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霍乱弧菌

霍乱弧菌是一种天然的自由生活细菌，广泛分布于水生环境以及人类宿主的环境中。霍乱弧菌是一种非侵入性肠道病原体；O1和O139血清群引起腹泻病霍乱。首次报道的靶向真核细胞的T6SS毒素是VgrG-1，是一种能够使宿主 细 胞 肌 动 蛋 白 共 价 交 联 的 酶，此酶 与T6SS 依赖的巨噬细胞毒性密切相关。在霍乱弧菌被巨噬细胞吞噬后，VgrG 蛋白发挥作用，分泌酶使肌动蛋白共价交联，破坏细胞骨架，从而使宿主巨噬细胞失去吞噬作用。不能产生这种蛋白质的突变体缺乏分泌Hcp或感染变形虫和哺乳动物巨噬细胞的能力。VgrG-1携带大的（395个氨基酸）C-末端延伸，与MARTX家族成员RtxA毒素的肌动蛋白交联结构域（ACD）具有同源性。VgrG-1在体外以Mg2+/Mn2+-ATP依赖性方式催化两种G-肌动蛋白单体的共价交联，并且体内诱导巨噬细胞和婴儿小鼠收获的肠中细胞溶质肌动蛋白的大量交联。肌动蛋白低聚物破坏肌动蛋白丝中正常的亚基间界面并阻止聚合。VgrG-1 ACD结构域易位至吞噬细胞以损害其功能并导致细胞死亡，防止细菌从肠道清除。VgrG-1在ACD表面也具有类似于WH2结构域的肌动蛋白结合基序（ABM）。该ACD-ABM抑制肌动蛋白成核，因为该基序可以结合和螯合肌动蛋白单体；该结合域对于ACD介导的肌动蛋白交联也是必不可少的。VgrG-1通过与VgrG-2和VgrG-3相互作用形成同源三聚体和异源三聚体复合物。

另一个值得注意的T6SS霍乱弧菌蛋白是毒力相关分泌蛋白X（VasX或VCA0020），编码在hcp和vgrG-2下游的T6SS基因簇中。VasX在T6SS介导的毒力中起作用，通过依赖于肌动蛋白交联的机制杀死变形虫。VasX带有一个N末端Pleckstrin同源性（PH）域，该域与膜脂质结合，包括磷脂酸（PA）和每种磷脂酰肌醇磷酸酯（PIP）。由于在细菌中很少发现肌醇磷酸酯，因此VasX的PH结构域可能在与宿主膜脂质结合中起作用，并被认为在脂质双层中形成孔。VasX还带有一个名为MIX（六型效应子的标记）和一个C端大肠杆菌素结构域的基序，对其分泌和T6SS组装很重要。

蛋白水解弧菌

蛋白水解弧菌（Vibrio proteolyticus，Vpr）是一种海洋细菌，以前曾从黄带病珊瑚中分离出来。通过分析Vpr分泌蛋白组鉴定了三种具有推定的抗真核活性的T6SS效应子。Vpr01570包含一个N端MIX V域和一个C端CNF1（细胞毒性坏死因子1）脱酰胺酶域，该域靶向并激活Rho GTPases。在巨噬细胞中外源表达的Vpr01570诱导肌动蛋白细胞骨架重排，包括以T6SS依赖性方式在细胞顶部组装收缩性肌动蛋白应力纤维和褶皱。Vpr01570在酵母中表达时会诱导毒性，这些作用取决于CNF1结构域。Vpr01580编码在Vpr01570编码基因旁边，还含有MIX V结构域；其同源蛋白具有细胞毒性并含有Rhs重复序列。Vpr00400与具有杀虫活性的毒性蛋白Txp40的C末端结构域同源。需要进一步的研究来阐明Vpr01580和Vpr00400的作用。

大肠杆菌

肠出血性大肠杆菌（EHEC）是导致全世界血性腹泻和溶血性尿毒症综合征爆发的人类肠道病原体。KatN与肠沙门氏菌的含Mn2+的过氧化氢酶KatN具有84%的同一性，KatN的比活性为268.3 U/mg蛋白。KatN有助于EHEC对体外氧化应激的反应；OxyR和RpoS参与KatN转录激活和H-NS（一种全球调节因子）的抑制。吞噬后，EHEC诱导T6SS的表达，易位的KatN通过水解和降低活性氧（ROS）水平，为细菌生长和进一步感染提供理想的生态位，促进巨噬细胞内细菌的存活

肠外致病性大肠杆菌（ExPEC）菌株可在非肠道部位引起尿路，血流，前列腺和其他感染，导致人类和其他动物的疾病。它们对人类公共健康构成严重威胁，对食品安全构成高风险。猪ExPEC引起脑膜炎，肺炎，关节炎和败血症，并且是多药耐药性的。VgrG蛋白是核心成分和T6SS效应子，除了其结构成分作用外，还具有作为效应子的多种功能。ExPEC VgrG1在细菌粘附，增殖中起作用，并且在逃避先天免疫应答中起主要作用。在没有VgrG1的情况下，小鼠血清IL-1β水平显着降低。

假单胞菌

最具毒性的机会致病菌之一是铜绿假单胞菌，常见于土壤和水中以及植物和人类中。铜绿假单胞菌具有代谢功能，可引起癌症，囊性纤维化和烧伤患者的各种严重机会性感染。铜绿假单胞菌基因组编码三个进化上不同的T6SS簇，H1-3-T6SS，它们同时表达，每个簇分泌一组可变的毒素。H1-T6SS靶向细菌，而H2-3-T6SS靶向细菌，也参与真核细胞的内化。

Phospholipases D (PLDs) 磷脂酶D（PLD）仅在非常有限数量的原核生物中发现，但是当存在时，它们通常在细菌发病机理中起作用。来自铜绿假单胞菌的122kDa蛋白质PldA（Tle5a）与真核pLD具有高度同源性；该蛋白质通过H2-T6SS分泌并通过其同源VgrG4b作为货物效应物递送.PldA具有两个HXKXXXXD催化基序并且其具有磷脂酶钙调节体外活性。导致磷脂酰胆碱水解的PldA酶活性取决于催化组氨酸残基（H855）。PldA可通过PLD活性通过PA积累诱导细胞死亡，主要针对磷脂酰乙醇胺。

83 kDa蛋白PldB（Tle5b）是铜绿假单胞菌H2和H3-T6SS依赖性PLD效应子，通过其同源VgrG5传递，能够转移到人上皮细胞中。PldB拥有两个在毒性中起关键作用的HxKxxxD催化基序。PldA和PldB不具有同源性，表明它们通过趋同进化发展了类似的功能。一项研究破译了临床分离株中编码T6SS效应子的基因的流行，发现在导致严重急性肺部感染和败血症的分离株中pldA的流行率增加。相反，所有分离株中pldB的患病率都很高。PldA和PldB不参与细菌粘附，但通过激活对细胞生长，增殖和程序性细胞死亡至关重要的磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/Akt信号传导途径促进宿主真核细胞的细胞内侵袭。注射入上皮细胞后，PldA和PldB直接与Akt1和/或Akt2激酶相互作用，导致PI3K-Akt途径的激活。实际上，丝氨酸473处的Akt磷酸化促进了顶膜的重塑，其中富含磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）和肌动蛋白的突起使细菌进入。

VgrG2b在假单胞菌基因组数据库中存在的所有铜绿假单胞菌菌株中都是保守的。VgrG2b是一种113kDa的蛋白质，含有与gp27和gp5噬菌体尾蛋白同源的保守VgrG结构域，其后是功能未知的结构域DUF2345，以及具有Zn2+依赖性金属肽酶结构域（LFIHEMTHVW）的C末端延伸。它是一种进化的VgrG，具有作为分泌机制的结构组分的双重功能，并且是通过入侵宿主细胞所需的H2-T6SS易位的真正效应子。VgrG2b注射先于内化；其C-末端结构域与α-和β-微管蛋白复合物以及γ-微管蛋白复合物如γ-微管蛋白小复合物（γTuSC）和γ-微管蛋白环复合物（γ-TuRC）参与微管成核。这种相互作用允许细菌摄入上皮细胞由肌动蛋白细胞骨架重排介导。包含残基833-1019（PDB 6H56）的Vgr2b C-末端的晶体结构呈现金属肽酶折叠。

Sana等（2016）提出了T6SS效应物PldA，PldB和VgrG2b在铜绿假单胞菌内化中相互作用的工作模型。首先，VgrG2b通过H2-T6SS易位，通过靶向微管网络引起上皮细胞的极化，通过与γ-TuRC相互作用促进膜上的微管成核。这些非径向微管成核的新位点干扰微管依赖性货物在细胞中的运输，如PI3K。同时，PldA和PldB通过不同的H2和H3-T6SS易位，激活Akt，使肌动蛋白依赖性膜突出，使细菌内化到上皮细胞。

另一种效应物TplE含有真核PGAP1（糖基化后磷脂酰肌醇附着于蛋白质1，post-glycosylphosphatidylinositol attachment to proteins 1）样结构域。TplE以H2-T6SS依赖性方式易位至上皮细胞并定位于宿主内质网（ER），引起核周边周围ER的收缩。TplE磷脂酶活性不参与定位，但是破坏ER结构是必需的。TplE诱导作为ER应激生物标志物的Bip和CHOP伴侣的上调并诱导XBP1 mRNA的剪接，表明TplE诱导的未折叠蛋白应答依赖于IRE1α-XBP1信号传导途径。据报道，TplE递送到人上皮细胞中诱导自噬通量。

克雷伯氏菌

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）是自然界中普遍存在的物种，是人类的肠道共生菌和机会性病原体。作为一种突出的医院病原体，它可以引起广泛的感染，包括尿路，呼吸道或血液感染，菌血症和肝脓肿。由于经常出现多种抗生素抗性分离株，肺炎克雷伯菌被认为是全球公共卫生问题。在肺炎克雷伯菌中，定义了三个不同的T6SS基因座，并且编码PLD家族蛋白Pld1的基因位于VI型分泌系统基因座内。Pld1是Tle5同源物，具有两个保守的HxKxxxD基序，并在肺炎克雷伯菌毒力期间在肺炎小鼠模型中表达。pld1磷脂酶突变体在体内强烈减毒，表明对肺炎克雷伯菌发病机制中的脂质代谢有影响。

VgrG4编码未知功能DUF2345的C端结构域。VgrG4是细菌诱导的真菌病原体白色念珠菌和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）杀死所必需的，暗示T6SS在真菌细胞的中毒中。DUF2345结构域足以产生抗真核生物活性。

弗朗西斯菌

土拉弗朗西斯菌（Francisella tularensis）是已知的最具传染性的细胞内病原体之一。通过皮肤，粘膜或呼吸道或胃肠道进入人体后，会引起tularemia，一种坏死性支气管肺炎，导致败血症和死亡。由弗朗西斯菌致病岛（FPI）编码的T6SS对该细菌的毒力至关重要。相反，F.tularensis subsp。novicida（F.novicida）在人体中具有低毒力，但在小鼠中具有高毒力，因此通常用作土拉菌病的实验室模型。PdpC（致病性决定簇蛋白C）是在FPI内编码的156kDa蛋白，其有助于吞噬体逃逸，运输至溶酶体和巨噬细胞内复制。PdpC在小鼠模型中的毒力中起作用，如ΔPdpC突变体所证明的，导致小鼠死亡率显着降低，器官中细菌负荷相应减少。需要PdpC来激活AIM2炎性体，并且ΔPdpC诱导较低水平的I型干扰素产生。

PdpD是FPI中编码的蛋白质；其输出需要VgrG和PdpA。该效应子有助于巨噬细胞内生长和吞噬体破裂。PdpD也需要激活AIM2炎性体。

OpiA和OpiB由位于FPI外部的开放阅读框编码，最近被确定为T6SS底物。它们有助于细胞内生长。在弗朗西斯菌之外没有发现OpiA的同源物，并且计算机分析无法鉴定蛋白质内的特征性结构域或基序。OpiB C末端与介导通常在真核蛋白质中发现的蛋白质-蛋白质相互作用的锚蛋白重复结构域同源。OpiB N-末端构成进化上可塑的半胱氨酸蛋白酶。OpiA属于渥曼青霉素抗性细菌PI3K酶家族，其成员存在于多种细胞内病原体中。OpiA可以磷酸化PI而不是PIP2。OpiA以选择性和高亲和力方式结合磷脂酰肌醇3-磷酸[PI（3）P]，作为OpiA特异性募集到内体膜的机制。OpiA作用于含有弗朗西斯菌的吞噬体，导致细菌从晚期内体逃逸到感染细胞的细胞质中。该蛋白质易位到吞噬细胞中并降低TNF-α的水平，TNF-α是阻断细胞内复制所需的来自单核细胞的促炎细胞因子。如使用鸡胚感染模型所证明的，OpiA有助于土拉弗朗西斯菌的发病机理。

蛋白质IglE（细胞内生长基因座E）易位至巨噬细胞中。ΔiglE突变体在人巨噬细胞中具有较慢的细胞内生长速率，表明该蛋白在细胞内复制中的作用。IglE与β-微管蛋白，pericentrin和微管组织中心相互作用。它抑制宿主细胞中基于动力蛋白的细胞内运输，使F.novicida逃脱与溶酶体的融合。

爱德华氏菌

迟缓爱德华氏菌感染多种宿主，包括鱼类，鸟类，爬行动物和人类。在人类中，它引起肠道和肠外感染，主要是免疫系统受损的个体。鱼类中的爱德华氏病是一种在全球水产养殖业中占主导地位的破坏性疾病，使其对渔业尤为重要（Zheng和Leung，2007）。EvpP（E。tarda毒力蛋白P）转录是铁依赖性的。EvpP是一种20 kDa的蛋白质，在其他细菌中不保守，并且不包含保守的结构域或基序。它通过T6SS分泌，EvpP C末端与EvpV（Hcp同源物）相互作用。在体内鱼模型中，EvpP在增殖和感染中起作用。该毒素还介导绵羊红细胞中的溶血活性，并有助于日本比目鱼的粘液粘附和血清抗性。EvpP对于carp细胞上皮乳头状瘤的内在化很重要。该蛋白在注射后位于膜中，并通过减少Jnk磷酸化和ASC寡聚化在NLRP3炎性体激活中具有抑制作用。据报道，ΔevpP诱导的细胞内钙通量高于野生型E.tarda，表明evpP介导的Jnk ASC操作可以追溯到细胞内Ca2+信号传导的上游

Edwardsiella ictaluri引起鲶鱼的肠道败血症，是鲶鱼养殖业中最重要的地方性传染病。EvpP毒素参与鲶鱼卵巢细胞中E.ictaluri的粘附和内化。EvpP在存在氧化应激和有限营养素的吞噬溶酶体中起生长调节作用，并且还有利于鲶鱼前肾巨噬细胞的存活并增加细胞凋亡和坏死。

爱德华氏菌（Edwardsiella piscicida）含有丰富的水，可引起鱼类，动物和人类的食物和水传播感染。使用体内斑马鱼幼虫感染模型EvpP通过Jnk MAPK信号级联抑制免疫细胞募集。EvpP降低cxcl8a（趋化因子配体8）和mmp13（基质金属肽酶13）转录物的表达，表明EvpP在抑制嗜中性粒细胞募集中起作用。同时，EvpP还抑制Jnk-caspy炎性体和IL-1β表达，抑制中性粒细胞募集，从而促进细菌定植。EvpP还能够减少膜联蛋白V的结合和参与凋亡的切割的半胱天冬酶-3的活化。该效应子与核糖体蛋白S5（RPS5）相互作用，最有可能导致巨噬细胞中凋亡相关途径的下调。

伯克氏菌属

伯克霍尔德氏菌（Burkholderia cenocepacia）在环境中广泛存在，特别是在根际内。B.cenocepacia也是一种机会性病原体，在囊性纤维化患者以及其他免疫功能低下的患者中引起慢性肺部感染（Loutet和Valvano，2010）。17 kDa蛋白TecA是负责体内肌动蛋白破坏的非VgrG T6SS效应子。TecA和其他细菌同源物带有半胱氨酸蛋白酶样催化三联体，其通过使GTPase switch-I区域中的保守天冬酰胺脱酰胺而使Rho GTP酶失活。RhoA脱酰胺诱导Pyrin炎性体激活（Aubert等，2016）。

Burkholderia thailandensis是一种低毒力的土壤腐生菌。Burkholderia pseudomallei是类鼻疽病的致病因子，类鼻疽病是一种严重且通常致命的人类感染。这些被称为Bptm组的物种编码几种T6SS，但VI型分泌系统5（T6SS-5）是哺乳动物感染模型中毒力所需的一种。VgrG-5是T6SS-5的底物，易位至巨噬细胞。VgrG-5 C末端结构域参与介导小鼠多核巨细胞形成，膜融合和毒力。

沙雷氏菌

粘质沙雷氏菌天然存在于土壤和水中。它与泌尿和呼吸道感染，心内膜炎，骨髓炎，败血症，伤口感染，眼部感染和脑膜炎有关。Tfe1（T6SS抗真菌效应物1）是抗真菌小T6SS毒素（20kDa），与野生型细菌相比，Tfe1编码基因的缺失导致活白色念珠菌靶细胞的回收率增加四倍。Tfe1在白色念珠菌的出芽和丝状形式中引起细胞变形和裂解。Tfe1抑制酿酒酵母的生长并诱导异常大的液泡和细胞裂解，证实了该效应物的杀真菌作用。Tfe1中毒导致膜电位损失导致膜去极化，这不是由于孔形成，而是可能导致膜完整性丧失和细胞死亡。去除Tfe2（T6SS抗真菌效应物2）编码基因，导致对酿酒酵母或光滑念珠菌的活性几乎完全丧失，并且对白色念珠菌的活性降低。Tfe2是一种小蛋白质（26 kDa），当在酿酒酵母中表达时，能够抑制其生长。Tfe2中毒破坏营养摄取和氨基酸代谢并引起自噬。Tfe1和Tfe2作用于真菌细胞中的不同细胞靶标。

气单胞菌

嗜水气单胞菌在淡水环境中很常见，并在鱼类，爬行动物，两栖动物和人类中引起疾病。它引起人类广泛的感染（包括败血症，脑膜炎，心内膜炎）和温水鱼类严重的运动性败血症。103kDa蛋白VgrG1由T6SS易位。VgrG1在其C-末端含有营养型杀虫蛋白结构域，具有肌动蛋白ADP-核糖基转移酶活性。该效应物改变肌动蛋白细胞骨架并诱导上皮细胞凋亡。

耶尔森氏菌

假结核耶尔森氏菌是一种肠道病原体，通常在环境中生长，可通过摄入受污染的食物或水传播给哺乳动物宿主。它通常引起广泛的胃肠疾病，从肠炎到肠系膜淋巴结炎。假结核耶尔森氏菌包含四个T6SS簇。T6SS-4分泌的底物YezP（耶尔森氏菌细胞外锌结合蛋白）是Zn2+结合蛋白，其具有在加入细胞外环境时拯救T6SS突变体表现出的对氧化应激的敏感性的能力。YezP在小鼠的毒力中起作用，但其对感染过程的贡献需要进一步研究。

一些抗真核生物效应物作用的当前模型的示意图

（A） Pseudomonas 通过诱导PI3K途径，将结合Akt的PldA和PldB传递给细菌。VgrG2b通过与微管γ-TuRC复合体的成员相互作用使细菌内化。TplE靶向内质网，诱导应激和自噬。

（B） B.cenocepacia TecA是一种脱酰胺酶，通过脱酰胺Rho-GTPases破坏肌动蛋白细胞骨架，激活 Pyrin inflammasome

（C）V. cholerae进化的VgrG1与肌动蛋白相互作用并交联，导致有毒肌动蛋白寡聚体的积累并改变宿主细胞形态。VasX结合脂质膜磷脂酸（PA），并被认为在脂质双层中形成孔。V.proteolyticus Vpr01570含有激活Rho GTP酶的脱酰胺酶结构域。

（D）F.tularensis OpiA是一种能够磷酸化磷脂酰肌醇（PI）并与磷脂酰肌醇三磷酸[PI(3)P]结合到内膜的激酶。PdpC和PdpD激活AIM2炎症体。

（E）E.tarda转移EvpP，它通过减少Jnk磷酸化和ASC寡聚作用来调节钙流量，并在NLRP3炎症体中具有抑制作用；EvpP与核糖体蛋白S5相互作用负调控细胞凋亡。

(F) Enterohemorrhagic E. coli 效应因子KatN是一种过氧化氢酶，通过水解和降低活性氧（ROS）水平促进巨噬细胞的存活。VgrG1由EXEC分泌，可改变IL-1β水平。

结论：

病原体的清除取决于在感染早期发生的宿主先天免疫反应，其中巨噬细胞和嗜中性粒细胞（macrophages and neutrophils）是必需的参与者。一旦进入巨噬细胞，细胞内细菌就可以存在于液泡或胞质溶胶中，这取决于它们的效应机制，这有助于它们逃避宿主防御并继续感染周期并复制。弧菌，假单胞菌，伯克霍尔德氏菌和气单胞菌物种（Vibrio, Pseudomonas, Burkholderia and Aeromonas）以T6SS依赖性方式转运毒素，导致对吞噬作用，炎性激活以及通过操纵肌动蛋白细胞骨架的细菌内化的抗性。弧菌，假单胞菌和伯克霍尔德氏菌（Vibrio, Pseudomonas, and Burkholderia）特别破坏宿主细胞细胞骨架，靶向肌动蛋白，尽管假单胞菌和弗朗西斯菌（Pseudomonas and Francisella ）效应物靶向微管（microtubules）。对免疫途径的干扰是T6SS依赖性效应子实现的标志性功能。伯克霍尔德氏菌，弧菌，弗朗西斯菌属和爱德华氏菌（Burkholderia，Vibrio，Francisella和Edwardsiella）注射与不同炎症小体激活有关的毒素，导致促炎性细胞因子的分泌。在这种情况下，炎性体的激活对于清除病原体可能很重要，这提示T6SS效应子也可能具有抗毒因子的作用。

宿主防御的另一个重要机制是产生活性氧以根除细胞内细菌。大肠杆菌和耶尔森氏菌T6SS提供具有调节氧化应激和保护病原体免受ROS和允许生长的能力的效应物。最后，沙雷氏菌将效应物递送到真菌细胞中，引起质膜去极化并破坏代谢，导致细胞死亡。

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