北京时间2024年6月4日晚，武汉大学刘郑与张兴华联合团队在Cell杂志在线发表了题为 “DNA-based ForceChrono Probes for Deciphering Single-Molecule Force Dynamics in Living Cells” 的研究论文。

研究团队开发了一种名为力-时荧光探针（ForceChrono Probe），利用单分子荧光成像技术，首次在活细胞中实现了对单个整合素分子上的力传递的持续时间、力学加载速率以及机械力强度的同步测量，并展示可以通过分析蛋白突变、缺失或药物干预对这些机械参数的影响，判断出特定蛋白质或结构域在细胞机械传导中的功能作用。

这不仅为在单分子水平上揭示细胞机械力动态特征提供了一个全新的工具，也表明许多单分子力谱数据需要针对生理力学负载速率和力持续时间进行调整解读。

机械力在细胞信号传导中扮演着与传统生化和电生理信号不同的重要角色。由于细胞表面受体传递的力非常微小，仅有几个到几十pN，其动态特征使测量极为困难。除了力的大小，力的持续时间和加载速率也对细胞信号转导和行为有深远影响。力的持续时间决定了信号传导的时长，而加载速率影响蛋白的展开和激活。此前文献估算及体外实验中的力学加载速率范围非常广，从0.007到106 pN/s不等，并且，对活细胞中力传递持续时间的信息了解更为缺乏。这些原因导致研究人员在解释现象时需要粗略假定一个宽泛的速率或持续时间，这造成对细胞力学传导理解的混乱。因此，对细胞力学传导过程的精准测量对于深入理解细胞内机械信号传导的机制至关重要。

在这项研究中，作者提出了一种力-时荧光探针（ForceChrono Probe），其采用了一对DNA发夹结构，精心构造，使其可以在活细胞中响应细微的机械力。每个发夹都配备了一种独特的荧光分子标签——低阈力发夹（F1）绑定了发绿色荧光的Cy3B染料，而高阈力发夹（F2）则带有发红光的Atto647N染料，两者共同作用，构成了一种高度敏感的力分层感测系统。在这两个精细调校的DNA发夹之间，策略性地放置了一种荧光猝灭基团BHQ2，并通过固定在一个直径为3.5纳米的金纳米粒子上，利用纳米尺度的金表面共振能量转移来提供额外的荧光猝灭效果，进一步增强光学灵敏度和稳定性。使得在无力作用时，荧光保持“关闭”状态，当细胞施加力量时，这种精密的双发夹系统会依次展开，首先是阈值较低的F1，然后是阈值较高的F2。这种展开过程会导致不同颜色的荧光分子的荧光依次恢复，通过精确测量两个发夹展开之间的时间间隔（Δt1）以及第一个发夹打开后保持开放的持续时间（Δt2），研究人员可以精确地测定力的持续时间和计算平均加载速率。研究发现，在多种细胞系中，单个整合素施加力的持续时间从几十秒到最大100 秒范围，加载速度约在0.5～2 pN/s范围，与粘附斑的成熟度密切相关。

图1. 用于测量单个膜蛋白机械力加载动态的力-时探针的设计以及测量原理

由于ForceChrono 探针可以允许研究者在单分子水平上将整合素机械力大小与力传递时间进行关联分析，作者通过这些探针将整合素分为两类：I类整合素施加较低的力（F1 < F < F2），而II类整合素施加较高的力（F > F2）。单分子荧光成像技术揭示，I类整合素在细胞粘附和迁移过程中表现出高度动态性，施加的力较小且持续时间较短。相比之下，II类整合素则表现出不同的趋势，其力的“闪烁”事件频率较低，力的持续时间则明显延长，显示出更高的稳定性。这表明，在较低的机械阈值下整合素-配体键通常不稳定，然而，当力超过一定阈值后，整合素-配体键则表现出显著的稳定性。

图2. 研究整合素机械力的大小和持续时间之间的关系

为了进一步探索单分子力学加载动态特征，作者在不同力学区间测量了整合素机械力加载速度，发现在较低力范围内(5~19 pN)的加载速率大约是0.6 pN/s，而较高力范围(17~41 pN)则能达到1.5皮牛/秒。这种非线性的加载过程在不同类型的细胞中有所展示，进一步的研究细胞骨架相关蛋白显著的影响机械力加载速度，如肌动蛋白结合蛋白——filamin A的缺失会降低了整个力范围内的加载速率，尤其是在低力范围内，而α-actinin-4的缺失则主要影响较高力范围的加载速率。并发现抑制肌球蛋白活性，整素的加载率会显著下降，显示出肌球蛋白在细胞力生成和调节中的核心作用。

图3. 在不同力学范围的力加载率测量

在细胞如何感知并响应外界力的过程中， Vinculin是一种关键蛋白，通过将整合素与talin复合体连接到肌动蛋白骨架，帮助细胞动态地与外界基质结合和脱离。虽然其与talin的相互作用在体外单分子实验中已被广泛研究，但vinculin对细胞内整合素力传递的具体影响仍不完全清楚。为了深入探究，研究团队使用缺乏vinculin的小鼠胚胎成纤维细胞系（Vcl KO MEF）进行了实验，发现vinculin的缺失会显著削弱单个整合素机械力大小，进一步的单分子力-时荧光探针成像显示，Vcl KO细胞的单分子力信号短暂且快速波动，显示出更高的加载速率和极短的力持续时间(～16 秒)，表明缺失vinculin导致整合素介导的力传递过程的稳定性受损。此外，为了更好地理解vinculin的作用，研究团队还引入两种全长vinculin突变体：vinA50I（缺乏talin结合能力）和vinI997A（缺乏肌动蛋白结合能力），并观察回补后它们如何影响整合素力学动态行为，结果显示与talin结合域在维持力传递和细胞粘附中的不可或缺作用。因此，vinculin不仅是力的传递者，还是机械转导途径中的关键调节器，通过调节细胞层面上机械力的持续施加和稳定性，影响像YAP这样的机械敏感分子的核内转移。

图4. Vinculin在整合素机械转导中作用的研究

此外，研究团队还通过一系列实验研究细胞外基质中配体的密度如何影响整合素的力学行为。配体密度是细胞如何形成粘附结构的关键，这些结构直接影响细胞如何感知和响应机械力。利用纳米技术，团队制造了配体间距为40纳米和100纳米的基质，研究发现在低配体间距下(40 nm)，整合素力的表现稳定；而在高配体间距下(100 nm)，单分子信号显示出快速闪烁的特征，这与更高的加载速率和较短的力持续时间相对应。这表明在大间距条件下，整合素与talin和肌动蛋白的连接不稳定，细胞需要快速施加力以重建这些断裂的连接。这些发现揭示了ECM配体密度是如何深刻影响整合素力动态的，进而影响细胞的粘附稳定性和机械响应。

图5. 不同配体间距调控力学传导动态过程研究

综上所述，作者开发一种新型单分子力学成像技术，可在多维度上表活细胞上单个膜蛋白传递的机械力特征，包括力的持续时间、加载率以及力学强度。通过分析蛋白质突变或药物干预如何影响这些力学时间参数，从而可以判断出特定蛋白质或蛋白质结构域在错综复杂的细胞机械传导过程中的功能作用，这为在分子水平上阐明细胞机械传感与下游信号级联反应（包括免疫识别、干细胞分化和肿瘤转移）之间的联系提供了独特的工具。

据悉，该文章从投稿至接收只经历了70天，在同行评议期间，美国HHMI、哈佛大学Taekjip Ha课题组在Science上报道了通过开发基于DNA过度拉伸的单分子张力传感器 (Science, 383,1374, 2024)，并结合单分子光镊实验，测量了活细胞中单分子力的加载率（注：该技术无法测量力传递持续时间）。他们的研究结果显示，细胞内单分子力的加载率约在0.5 pN/s～4 pN/s之间，与本文的发现几乎一致。

武汉大学高等研究院胡钰茹博士、李洪云博士（已毕业，现为美国宾州州立大学博士后）、生命科学学院张晨博士和高等研究院博士生冯晶晶为论文的共同第一作者，武汉大学高等研究院/泰康生命医学中心刘郑教授、李洪云博士以及武汉大学生命科学学院张兴华教授为该论文的通讯作者。

相关论文信息：

https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.05.008