细胞色素P450是一类以血红素（heme）为辅基的庞大酶超家族，广泛参与包括脂肪酸、植物固醇、植物激素和苯丙素类等代谢物的生物合成。植物苯丙素类-木质素单体合成途径形成众多的酚类化合物，并为细胞壁木质素提供前体。此途径中的三个P450酶，C4H，C3’H和F5H1催化了羟基肉桂酸类化合物的形成，决定了植物中游离酚的不同种类以及细胞壁木质素的三种结构类型， 即H-， G-和S-型木质素。作为直接行使单加氧反应的末端酶，P450的功能得到广泛研究，然而其电子传递系统（成员包括CPR，CBR和CB5）在植物代谢物合成中的功能鲜有关注。内质网上有两类还原酶，CPR和CBR，可以分别利用NADPH和NADH来传递还原力，二者皆可以还原细胞色素B5 （CB5）蛋白，长期以来CPR被认为是P450的主要电子供体。刘长军实验室前期研究发现，拟南芥的CB5 家族成员CB5D是P450 酶F5H1不可或缺的电子供体（Plant cell, 2019）。CB5D可同时接受CPR和CBR传递的电子，这些电子传递蛋白在促进F5H1功能时的具体分工机制是怎样的？在苯丙素类-木质素单体合成途径中的另外两个P450，C3’H和C4H的功能发挥是否也需要CB5D的协助？

在本研究中，作者发现，1）拟南芥苯丙素类-木质素单体合成途径中的P450从不同的电子传递链获取还原力，植物进化早期形成的C4H利用了经典的NADPH-CPR途径，而进化后期形成的F5H1可以同时从NADPH-CPR-CB5和NADH-CBR-CB5两种途径获得还原力；而且，2）在不同的植物组织中，F5H1从不同的电子传递链获取还原力形成不同的酚类物质。在茎中，F5H1主要以NADPH-CPR-CB5途径获取还原力促进S-型木质素的形成， 而在种子中，F5H1主要从NADH-CBR-CB5途径获取还原力合成种子中游离的、以及与种皮木栓质结合的芥子酸脂；3）造成电子传递在不同组织中分化利用的原因可能取决于NADH和NADPH在植物不同组织中的含量、电子传递链成员在不同组织中的表达水平、以及CPR和CBR还原酶对CB5进行还原的效率差异，这三种因素综合调控了F5H1催化的反应。

拟南芥的CB5家族有5个成员，其中4个定位于内质网，为了确定内质网定位的CB5的潜在功能冗余性，作者创制了内质网定位的CB5基因四突变体，这个四突变体中的S-型木质素并没有在CB5D单基因突变体的基础上进一步显著降低，而且其它三个CB5并不能互补CB5D基因单突变体缺陷，说明CB5D是为F5H1提供还原力的最主要成员。同时观察到四突变体中的G-型木质素含量不但没有降低，反而略有增加，说明控制G-型木质素前体的P450酶C4H和C3’H功能并不受CB5的调节。在酵母中进行蛋白质互作研究发现，CB5D与拟南芥的CBR和CPR都可以互作，进一步通过对原核表达纯化的电子传递蛋白进行体外测试发现，拟南芥的CBR和CPR都可以有效地还原CB5D，但CBR对CB5D的还原效率显著高于CPR。但是，CPR基因突变体，而非CBR基因突变体显著影响了茎中S-型木质素的含量。

进一步分析发现，种子中游离的以及与种皮木栓质结合的芥子酸脂含量在CBR基因突变体中明显降低，而在CPR基因突变体中则只有略微降低。这说明在不同的组织部位中，CBR和CPR为F5H1提供电子的能力不同。作者进一步分析了造成这一现象的原因、发现CPR和CBR在不同组织部位中的基因表达水平、CPR和CBR对CB5进行还原的不同效率、以及NADH和NADPH在不同组织中的积累水平综合影响P450酶对对电子传递链的选择。最后，利用合成生成学的手段，作者在酵母中重构了C4H和F5H1的电子传递系统，为了减小不同实验组中外源蛋白表达量的差异，C4H和F5H1 P450基因以及电子传递成员经由2A片段连接构建在同一载体中共表达。通过酵母菌饲喂实验以及微囊体活性测试，作者确认了C4H主要接收NADPH-CPR传递的电子，而F5H1则可以同时利用NADH-CBR-CB5和NADPH-CPR-CB5传递的还原力（该方法以Book Chapter形式发表于Methods in Enzymology一书）。

图1. 拟南芥C4H和F5H1利用不同的电子传递链获取电子

综上，本研究发现了植物调控酚类化合物形成的P450酶活性的另一层分子机制， 即电子传递系统。对P450—电子传递链互作的研究有助于进一步了解P450系统是如何运作的，这将使我们可以根据P450对电子传递链的偏好性创造出更有效的酶系统，从而加强有机碳源的转换和储存，并定向获得所需的生物制品，提高投入产出比。

论文的通讯作者是刘长军（Chang-Jun Liu）研究员，赵先海（Xianhai Zhao）博士为第一作者，课题组早期成员赵运军（Yunjun Zhao）博士和苟明月（Mingyue Gou）博士为共同作者。

相关论文信息：

https://www.science.org/doi/epdf/10.1126/sciadv.ade4389

参考文献