人类基因组计划的完成使得我们辨识和了解了许多的人类基因。一个重大发现是，超过50% 的人类基因组是转座子序列 (1)。转座子（又称之为跳跃基因）是一类可以在基因组中自我复制和粘贴的DNA元件，早在20世纪50年代被美国遗传学家Babara McClintock在玉米中首次发现(2)。她本人也因此发现在1983年获得诺贝尔生理学奖。转座子主要可以分为两大类，DNA转座子和反转录转座子（retrotranspons)。其区别在于，反转录转座子会先转录生产RNA，再反转录成DNA来完成转座。LINE-1 (Long interspersed nuclear elements) 是人类基因组中已知丰度最高(碱基数目）的反转录转座子（约50万个拷贝），大约占到人基因组序列的17% 。LINE-1 也是人类基因组中目前已知的唯一一类可以自发转座的转座子。

但目前的研究表明，绝大多数的LINE-1已经发生突变或者片段丢失从而失去了转座的能力，据估计只有100-150个左右的LINE-1还具有活跃的转座能力(3)。在这篇论文中作者们既探讨了具备转座活性的LINE-1的调控和活跃转座（称为Retrotransposon-competent L1， 或RC-L1），也研究了大多数失去转座能力的LINE-1在内含子中的基因调节作用（图一）。

图一：示意图表示存在人类基因组中的LINE-1存在有极少数的具备转座活性的RC-L1和绝大多数哦失去转座活性的L1的区别。红色星号示意突变。

完整的LINE-1转座子的过度转座活性对于维持基因组的稳定性是不利的，在有些情况下会促进癌症或其他疾病的发生。为了抑制LINE-1的转座活化， 宿主细胞利用了DNA甲基化、异染色质形成等一系列的分子机制在转录和转录后各个层面去抵抗。即使这样，仍然有一些LINE-1能够逃逸抑制并且跳跃到新的位点，这些新的位点很大量的位于基因的内含子（intron)区域。这些新的LINE-1有些时候也能导致疾病的发生或发展 (3)。然而，宿主基因和转座子之间的相互关系和作用机制还亟待研究。

在哺乳动物中，m6A 是已知的一类最丰富的RNA甲基化修饰 (4)。近些年来如火如荼的RNA甲基化研究表明m6A修饰和其相关蛋白在很多生物学过程和疾病发生中起到重要作用(5)。得益于MeRIP-Seq等技术的发展，m6A在mRNA上面的分布可以得到很精确地解析。但是，对于m6A在新生RNA（nascent RNA）比如内含子RNA以及其它丰度较低的非编码RNA上的存在和功能我们知之甚少。为了解析m6A在此类RNA上面的分布，李文博课题组开发了一种新的m6A测序技术，作者们称为MINT-Seq （methylation inscribed Nascent Transcript Sequencing)，能高效的富集和定量检测新生成的RNA （Nascent RNA）上m6A的分布。 通过该MINT-Seq，作者们鉴别出很多位于内含子上面的全新m6A位点。进一步分析发现这些大多存在于内含子中的LINE-1上。作者在血液癌K562细胞中发现了接近4000个m6A修饰的内含子 LINE-1 （m6A-marked intronic LINE-1)，简称之为MIL（图二）。

图二：MINT-seq 发现了很多MIL（m6A-marked intronic LINE-1）（红色信号富集区）。

比较分析发现m6A的水平和 MIL RNA的稳定性呈明显的正相关，提示m6A可能能够促进这些LINE-1 RNA的表达或者功能。不仅如此，作者们发现这些MIL RNA序列在基因组上的方向通常是和包含这些序列的“宿主”基因（hosting gene）的方向是一致的，提示m6A在LINE-1上的写入机制依赖于RNA序列和转录过程，而非DNA序列。 对于MIL进一步的序列分析发现m6A水平高的MIL通常具有较高的m6A motif （RRACH) 密度，较长的长度，以及较少的突变。从LINE-1的亚家族方面看，进化上较为“年轻”的LINE-1 亚家族（比如LIHS，L1PA2）的m6A水平也整体高于更古老的LINE-1 亚家族。这说明一个可能性，即LINE-1在进化过程中逐渐累积了m6A, 和m6A对于LINE-1 可能是有益的论点一致。为了揭示m6A在MIL上的作用机制，作者通过分析ENCODE eCLIP 数据找到了一些富集于MIL的RNA结合蛋白，包括SAFB，SAFB2, HLTF和RBM15等。作者通过体外生化手段证实SAFB与MIL的结合主要通过m6A介导，提示SAFB可能参与MIL的调控。细胞生物学实验显示，敲低m6A转移酶复合物METTL3/14和RBM15会降低MIL的整体丰度而敲低SAFB会显著升高MIL的丰度。 

为了进一步探究m6A和SAFB是否会影响LINE-1的转座活性，作者们构建了LINE-1转座报告系统，发现敲低METTL3/14显著降低LINE-1转座活性而敲低SAFB显著升高LINE-1转座活性。这进一步说明了m6A本身对于LINE-1的活动是起到促进作用的, 同时SAFB蛋白通过结合m6A标记的LINE-1 RNA来抑制LINE-1的活性。需要特别提出的是，作者构建了一个LINE-1 RNA突变体转座报告系统，针对性的破坏了序列中的部分RRACH motif，从而降低了RNA的m6A水平。与原始LINE-1序列相比该突变体的RNA稳定性和转座活性均显著降低。该实验证明了m6A的直接作用于LINE-1的功能，避免了很多敲低调节蛋白实验所常常遇到的直接还是间接作用（direct effect or secondary effect）的困扰。

上面的结果说明，对于LINE-1序列而言，m6A是一个进化上且在分子水平上都有一定“益处”的调节元素。但是从另一个角度来看，其实LINE-1就如同人基因中中的”寄生虫“需要争取跳跃到别的基因组区域来更多的“繁衍”，那么被m6A强化过的LINE-1是否对人类基因表达或者基因组功能有特殊影响呢？这个m6A的对LINE-1调节机制有何疾病相关性呢？

图三：示意图。有几个方向可以思考m6A对LINE-1 RNA 修饰导致的双向作用，即一方面影响LINE-1的跳跃活性，另一方面影响宿主（人）基因组的功能和基因表达。

作者分析发现MIL富集于DNA 损伤及修复相关基因中，也富集在超长人类基因中，提示这些MIL可能调控这些宿主基因的表达。通过进一步分析新生RNA在宿主基因上面的分布,  我们发现MIL下游的转录水平往往显著小于其上游，并且转录水平的降低通常在MIL的末端发生骤变 (图一）。这一现象广泛存在于不同的MIL区域，并且其降低的程度和MIL的m6A水平呈正相关。这提示我们MIL可能作为一个内含子里面的转录路障（roadblock) 控制了RNA聚合酶的转录延伸，从而达到调控其宿主基因表达的功能。作者选择了分别位于PSMA1 和ZRANB3的内含子中的两个具有非常高m6A水平的MIL，实验发现，通过CRISPR/Cas9 将MIL敲除或者反转都将明显降低转录路障（roadblock）的效果并且引发宿主基因的表达显著上升至2-3倍，直接证明了MIL是基因转录调控的重要元件。与此同时，敲除内含子中无m6A或者低m6A的LINE-1基本不影响宿主基因的转录或RNA水平，说明转录路障效果是直接依赖于m6A的。不仅如此，作者们发现敲低SAFB会进一步加强转录路障的效果（SAFB的作用是抑制MIL的RNA水平）。这些结果提示内含子LINE-1的转录路障现象也受到MIL及其RNA结合蛋白调控。

作者们观察到，包含MIL的宿主基因常常是非常长的人类基因，有些甚至达到几百kb或者超过1Mb。这么长的基因很可能格外会受到MIL的调节。作者们于是特别的查看了MIL对于超长基因的调节作用。尤其有意思的是，人类大脑是已知表达超长基因比较显著的器官，而LINE-1在人脑发育中也存在非常特别的活性跳跃。作者们于是使用已发表的人胎儿脑组织的RNA m6A 甲基化图谱发现了，并使用了人iPS分化的神经前体细胞验证了，很多重要的神经发育或者突触形成相关的基因含有MILs，比如 GPHN (Gephyrin), UBE3A，CTNND2 (delta2-catenin), DLG2 (编码 postsynaptic density protein-93), CNTNAP4 and CTNNA2，或者神经递质受体基因比如GABA receptor type-A γ3 (GABRG3) 和Glutamate Receptor AMPA Type-4 (GRIA4)。并且这些基因确实是受到MIL调节的，SAFB和SAFB2的敲低能够显著影响这些重要人脑功能相关基因的表达。生物信息分析显示这些含有MIL的超长基因和影响自闭症等人类神经发育疾病有显著相关性。

图四：总结图。此图全面总结了这篇论文发现的m6A在LINE-1 RNA 上的修饰导致的双向调控作用，即影响LINE-1的跳跃，也影响宿主（人）重要基因的功能和表达。

总结来说，这个工作主要揭示了：1) m6A在新生的RNA上尤其是LINE-1上的广泛存在并且促进LINE-1的RNA水平和转座活性；2）很多MIL存在于人类基因的内含子中，他们会通过形成转录路障（roadblock）从而抑制宿主基因的表达，尤其表现出对DNA修复蛋白和超长人类基因的偏好；3）宿主的RNA结合蛋白SAFB能够识别并抑制这些MIL从而缓解转录路障效应对于宿主基因组的影响。这些结果发现了m6A对于LINE-1 RNA调控的新机制，揭示了新的内含子序列导致的基因转录调控模式，同时加深了我们对于转座子和宿主间相互作用的理解。这个新的发现对于了解超长人类基因在疾病中（尤其是神经系统发育疾病）的病态表达也提供了新的思路。

在同一期的Cell Research上，来自法国国家科学研究中心CNRS和蔚蓝海岸大学的Victor Billon 和 Gael Cristofari撰写了很全面的对于这个论文发现的评论（图五） (6)。

图五：Gael Cristofari组对此论文的评论。MIL转录路障（roadblock）的示意图，来源于(6)。

博士后熊峰博士和研究生王若愚为共同第一作者。博士后李宙炯（韩国籍）在此工作中做了重要贡献。美国德克萨斯大学休斯敦健康科学中心Liu Ying组（目前搬迁到了佛罗里达国际大学）提供了重要神经前体细胞等材料和其他帮助。此工作也得到麦格文医学院的蔡光磊研究组和博后Shin-Fu Chen，德克萨斯Texas A&M 大学韩冷组的大力协助。

李文博老师组目前有两个博后职位空缺，欢迎有志于表观遗传调控（尤其是增强子，三维基因组和非编码RNA）的同学加盟。请直接联系李老师 wenbo.li@uth.tmc.edu。

相关论文信息：

https://doi.org/10.1038/s41422-021-00515-8

参考文献