DNA复制是生命活动基础核心过程之一，复制叉是其基本功能单元。就人类细胞而言，复制叉主要包括母代DNA解旋酶系统 (MCM)，子代DNA合成酶系统 (PCNA-Polε/δ)，以及已解旋但尚未被复制的单链DNA-RPA部分 (ssDNA-RPA) 等。在复制过程中，多个复制叉高度协调，保证在较短时间内快速完成全基因组复制。

然而，在DNA复制过程中，细胞往往会遭遇来自内源 (和外源) 的复制阻滞 (Replication Stress, RS) ，潜在影响DNA复制的高效性准确性以及由错误复制而导致的基因组损伤。为了减小RS的影响并维持基因组稳定性，细胞会在RS发生时启动一系列的信号网路来调整在胁迫环境中DNA复制的进程。作为这一系列信号网路的首要核心单元，ATR承担了对RS的识别以及激活下游多种信号通路的重要功能。

在先前的研究中，研究人员发现在胁迫环境中复制叉会因复制阻滞而积累大量RPA，而ATR正是通过识别RPA的富集来识别RS并启动后续响应机制。然而，ATR如何“观察/感知/测量”单个复制叉上RPA的数量这一基本问题尚未得到解释。

超分辨显微成像技术得以将细胞内大分子复合物的组成构造看的”更清楚” (图1A)，但针对诸如细胞核内相对无序拥挤的复杂环境，仍需结合数理统计的方法对看似混乱的复杂超分辨图像进行深度挖掘，通过提取有效定量信息将图像看的”更明白”。在该项研究中，研究人员利用其先前开发的基于三阶相关函数的图像挖掘技术 (图1B，Nature Communications 2019)，分析了细胞核内单个复制叉上RPA的平均承载量。

分析表明，在正常复制的细胞中，抑制ATR的活性 (ATRi) 会导致平均每个复制叉上的RPA载量增加，而恢复ATR活性会在一定程度上还原单个复制叉的RPA载量 (图1C)，暗示了在无外源RS的情况下，ATR即与复制叉存在相互作用，调节控制复制叉的RPA载量。值得一提的是，在正常复制情况下ATR调控单个复制叉RPA载量是该研究首次确认的ATR的另一活性，与先前普遍接受的ATR负向调控复制起始这一活性相对独立，没有直接相关。

图1

为了进一步研究ATR对单个复制叉RPA载量的调控机制，研究人员检查了RPA2结构域上第33位丝氨酸 (RPA2-S33) 的磷酸化状态对RPA载量的影响。RPA2-Ser33是已知ATR对RPA磷酸化的首要靶点。研究表明，当Ser33被突变成Ala33 (S33A) 以防止磷酸化带来的电荷变化时，单个复制叉上RPA载量有所上升；而当其被突变成Asp33 (S33D) 以模拟磷酸化时，并不显著影响RPA载量，暗示了ATR对RPA2-S33磷酸化是ATR负向调控RPA载量的必要但非充分因素。

另一方面，研究人员利用体外单分子荧光共振能量传递技术 (smFRET) 检查了上述两种突变对RPA与单链DNA结合效率的影响。研究表明S33D突变会导致RPA2结构域与单链DNA结合松动，但未观察到该单点突变对整体RPA-ssDNA结合效率的显著影响，进一步暗示ATR对RPA2-S33的磷酸化有助于RPA从单链DNA脱落但并非RPA完全解离的充分因素。

最后，研究人员进一步分析了在外源RS存在环境下单个复制叉上RPA和ATR的载量。研究表明，在RS引发的RPA载量升高的同时，ATR载量伴随升高，暗示了ATR和RPA之间扩散驱动的随机碰撞反应模式的可能性。基于此，研究人员通过对RS引发的RPA累积、自由扩散的ATR与RPA的随机碰撞、以及ATR协助RPA解离等过程数值模拟，再现了上述实验事实，并以此提出了ATR-RPA随机碰撞的分子通讯机制 (图2)：在复制叉正常行进时，ATR因自由扩散与RPA发生随机碰撞，是ATR与RPA之间通讯的物理基础；当复制叉在行进中遇到复制阻滞时，RPA-ssDNA在复制叉处积累，ATR-RPA的碰撞截面增大，从而伴随ATR在受阻复制叉处的富集；富集的ATR有更高的概率与复制叉处的ATR激活因子碰撞实现ATR信号通路的激活，同时ATR的富集也为ATR之间的自磷酸化 (Auto-phosphorylation) 提供浓度基础，实现ATR信号的放大。

图2

该项研究阐释了ATR进行复制监控与其受激响应之间的基本物理关联，为以ATR抑制剂为核心的小分子抗癌药物的开发提供新的思路。

深圳湾实验室特聘研究员尹延东课题组诚招博士后、科研助理。课题组主要致力于开发新型超分辨显微成像技术及复杂图像的分析挖掘技术，并利用这些技术深入理解染色质结构对DNA复制、损伤修复、以及信息转录等基本生命过程的动态调控。

招聘信息详见：

https://www.szbl.ac.cn/careers/recruitment/62.html

相关论文信息：

https://doi.org/10.1016/j.molcel.2021.08.009