G蛋白偶联受体（GPCR）是人体内最大的膜受体蛋白家族，其在细胞信号传导中发挥重要功能，同时也与人体疾病密切相关，是40%以上的上市药物的作用靶点¹。根据结构和序列的差异性，人体中GPCR可分为A、B、C和F四种类型。近年来的结构功能研究分别揭示了A、B1、B2和F类以单体形式发挥功能的GPCP的激活机制^2-5。

研究显示单体GPCR偶联G蛋白采用相似的模式，即受体的激活使跨膜结构域TM6的外移，进而形成较大的口袋用于结合Gα亚基的C末端，从而激活G蛋白下游信号通路。然而长期以来，以二聚化形式发挥功能的C型GPCR偶联G蛋白的分子机制一直未能揭示，严重阻碍了人们对C型受体信号转导机制的理解。

C型GPCR主要包括代谢型γ-氨基丁酸受体（GABA_B）、代谢型谷氨酸受体（mGlu）、钙敏感受体（CaSR）和味觉受体1（Taste 1）等⁶。C型受体与众多神经和精神疾病相关，包括癫痫、疼痛、焦虑、抑郁、精神分裂症、药物成瘾、Rett综合征和癫痫性脑病等。GABA_B受体是第一个被发现和证明的GPCR异源二聚体，是C型二聚体GPCR的典型代表^7,8。

GABA_B受体广泛表达在中枢神经系统中，参与学习、记忆和突触信号传递等重要的生理进程⁹。GABA_B受体由GB1和GB2两个亚基组成，每个亚基分别由胞外结构域（VFT），七次跨膜域（TMD）和胞内域构成¹⁰。GABA_B受体激活采取典型的非对称性调节机制，即GB1的VFT负责配体识别，而GB2的TM偶联Gi/o蛋白调控下游信号。

刘剑峰/张岩合作团队在2020年国际首次鉴定全长GABA_B受体非激活态与激活态的精细三维空间结构，阐明了GABA_B受体激活时的构象转变过程，鉴定了正向变构调节剂的结合口袋，极大地促进了GABA_B受体的激活机制研究和靶向药物开发。同时，该工作还首次解析了低分辨的GABA_B-Gi复合物结构，发现由于潜在的空间位阻，二聚化的GABA_B受体仅能偶联一个G蛋白¹¹。然而其非对称激活和偶联G蛋白的信号转导的分子机制还未被揭示。

本研究团队在前期工作的基础上再次进行课题攻关，先后突破复合物组装、均一冷冻样品制备、动态构象数据处理等挑战，最终完成高分辨GABA_B受体-Gi蛋白复合物的电镜结构鉴定（图1a）。结构分析发现与单体GPCR不同，GABA_B受体偶联G蛋白时，两个亚基跨膜域的TM6均没有发生外移，但是GB2亚基的TM3和TM5却发现较小幅度的外扩，使三个胞内环形成一个较浅的口袋结合G蛋白。与单体GPCR相比，G蛋白α5螺旋插入GABA_B受体的深度低了～10Å，并且主要与胞内环互作。

这些结果结合以前的其他C型GPCR功能研究，推测C型GPCR二聚体都采用了这种不同于A、B1、B2和F类GPCP的激活的独特的G蛋白偶联模式（图1b-d）。

此外，研究发现了GABA_B偶联G蛋白后的精细构象变化，包括GB1和GB2之间的旋转，以及GB2亚基TM的细节变化。通过结构分析，研究人员发现结合激动剂的GABA_B受体偶联G蛋白后，其GB2-TM相较于GB1-TM产生进一步的逆时针旋转，使得GB1和GB2的跨膜域界面进一步靠近，稳定激活状态。研究人员专注于GB2-TM的内部精细的构象变化，分析发现GB2 TM3/TM5胞内端的构象变化是起始于TM3上F586侧链苯环的大角度旋转。

信号转导实验分析发现，将F586突变成小侧链丙氨酸后，受体偶联G蛋白的能力显著下降。此外，在GB2-TM的底部，多个带电荷的氨基酸形成的盐桥进一步稳定了受体的激活态,从而揭示了GB2亚基结合G蛋白的结构基础（图2）。GB2亚基这些独特的构象的变化，最终决定了GABA_B偶联G蛋白的非对称性激活模式。

GABA_B主要通过3个胞内环偶联Gi蛋白：其中较长的ICL2主要与G蛋白上α5，αN，β2-β3的结合，占据了约80%的互作界面；而较短的ICL1、ICL3主要与G蛋白的α5末端几个氨基酸相互作用，稳定了G蛋白的结合（图3a，b）。此外研究发现GABA_B受体选择性识别Gi/o亚型G蛋白是由于Gi/o的H5.23位点是小侧链的半胱氨酸，而Gs、Gq等类型G蛋白的相应位置大侧链的酪氨酸与GABA_B受体具有潜在的空间位阻（图3c）。

功能实验分析发现，当把H5.23位点的半胱氨酸突变成大侧链的色氨酸后，其偶联G蛋白的能力显著降低，而当突变成小侧链的丙氨酸后，其结合G蛋白的能力没有变化（图3d，e）。

该项工作完整地阐述了C型异源二聚体GABA_B受体的非对称激活机制：在非激活状态下，GABA_B受体两个亚基的VFT区都处于开放状态，TM区采用TM3-TM5/TM3-TM5互作界面；激动剂结合GB1-VFT正位口袋后，诱导GB1-VFT闭合，从而使得GB2-VFT旋转，进一步由颈区传导至TM结构域的重排，形成新的TM6/TM6作用界面；PAM以及G蛋白的结合，进一步诱导了GB2的TM区的旋转，形成更稳定的TM6/TM6互作界面；此外GB2亚基F568等残基精细的构象变化，导致其TM3/TM5的胞内端外移，三个胞内环形成较浅的口袋选择性偶联Gi/o蛋白，最终激活下游信号通路（图4）。

本研究是浙江大学—华中科技大学细胞信号转导联合实验室在C型GPCR信号转导机制研究中的又一重大突破。该工作也进一步验证了刘剑峰课题组之前发现的C型GPCR二聚体，如代谢型谷氨酸受体（Nat Chem Biol.，2015; PNAS., 2011），GABA_B受体（Cell Research，2020; Nat Commun.，2019；EMBO J.，2008）和钙敏感受体（PNAS.，2020）中不同亚基的各个功能域变构调节的激活模式。

华中科技大学与浙江大学医学院联合培养博士生申仓松、浙江大学医学院附属邵逸夫医院毛春友研究员、华中科技大学教师许婵娟和博士生晋楠为本研究第一作者。华中科技大学生命科学与技术学院刘剑峰教授，浙江大学医学院张岩研究员和法国功能基因研究所PIN JP教授为共同通讯作者。

浙江大学医学院蛋白质平台、冷冻电镜中心为本次研究的样品制备和数据收集提供了支持。该工作也得到了浙江中医药大学陈忠教授，浙江大学药学院侯廷军教授和法国功能基因研究所Rondard P教授的协助。本工作得到了科技部国家重点研发计划、国家自然科学基金等项目的大力支持。