不孕不育是一种非常普遍的疾病，影响着全球约7000万人的生活。据世界卫生组织（WHO）统计，目前全世界的育龄夫妇中约有9%在与生育问题作斗争，其中男性因素占约50%。少、弱精症或畸形精子症的高发是男性不育的主要原因，男性精子的质量呈逐年下降的趋势已经变成一项世界性的问题。

溶质载体（SLC）转运蛋白家族是人类基因组中第二大膜蛋白家族，是细胞内最大的一类转运蛋白家族，可以分布在细胞内从核膜到细胞质膜的各种生物膜结构上。SLC 易感位点已被发现与多种代谢性疾病有强烈相关性，这些疾病包括胰岛素抵抗、2 型糖尿病、高血压、慢性肾病、痛风、哮喘、炎症性肠病、癌症、痴呆和焦虑症等。SLC22A14是在哺乳动物中进化保守的SLC22亚家族成员，特异性地表达在雄性生殖细胞中。本研究利用CRISPR-Cas9技术构建了Slc22a14 基因敲除的小鼠，发现雄性纯合子敲除小鼠是不育的，然而SLC22A14 的生物学功能和底物却完全未知，其致病机制尚不清楚。

作者首先利用CASA 系统和体外受精试验分析发现了Slc22a14 敲除引发精子的运动能力严重受损，致使精子无法穿透透明带使卵母细胞受精。进一步研究发现Slc22a14 KO精子ATP水平显著降低，证实Slc22a14在某种程度上参与了精子的能量代谢。精子的运动主要依靠鞭毛主段的摆动产生助推作用，而鞭毛主段富含糖酵解酶类，因此一直以来，精子尾部的糖酵解被认为是人类和小鼠精子运动的主要能量来源。然而，越来越多的证据表明脂肪酸代谢在精子能量生成中的重要性。

图1 SLC22A14调节精子能量代谢过程示意图。

针对附睾尾部精子的代谢组学和脂质组学分析表明Slc22a14敲除的精子内长链脂肪酸氧化和TCA 循环的中间代谢物显著减少，并且发生了长链游离脂肪酸和甘油三酯的蓄积，而糖酵解过程发生代偿性升高，但仍不能弥补ATP生成的不足。

作者接下来采用放射性和非放射性同位素示踪技术，检测了碳同位素标记的葡萄糖和脂肪酸底物在精子内的代谢情况，同时利用能量代谢分析仪评估了精子细胞耗氧量和胞外产酸值的变化，最终证实Slc22a14 敲除的精子内长链脂肪酸β-氧化（FAO）和氧化磷酸化（OXPHOS）途径均存在缺陷，并且糖脂氧代谢途径发生了重编程。作者发现，游离脂肪酸约占精子内总脂质含量的25%，并且多种FAO相关蛋白质在精子内呈高丰度表达，而尽管FAO产ATP的量只占正常精子ATP生成总量的30%，但它对精子的运动和生育能力是不可或缺的。

作为一个转运蛋白，SLC22A14的细胞内定位是什么以及通过转运何种底物来发挥作用的呢？作者利用蛋白质质谱分析技术和超高分辨率显微成像技术发现，SLC22A14是定位于精子线粒体内膜的转运蛋白。精子是高度特化的一类细胞，无法大量体外扩增，并且在体外存活时间短，很难分离出有活性的线粒体。因此，作者采用SLC22A14过表达稳定细胞系作为研究模型，结合线粒体代谢组学、放射性或非放射性同位素标记底物摄取实验以及核黄素缺乏的小鼠模型，鉴定出了核黄素为SLC22A14的底物之一。

核黄素是FMN和FAD的前体，是FAO、TCA 循环、ETC 复合物I 和II 的辅因子。此外，作为抗氧化剂，核黄素还可以保护细胞免受氧化损伤。Slc22a14基因敲除干扰核黄素进入线粒体基质的运输过程，导致FMN和FAD耗竭和黄素酶活性降低，从而抑制ATP的合成，诱发精子功能损伤以及雄性不育。

图2  SLC22A14位于线粒体内膜，通过转运核黄素介导精子的长链脂肪酸氧化过程并影响精子的受精能力。

该研究首次对精子这一特殊细胞类型的能量代谢展开较为系统的研究，填补了精子能量代谢领域和线粒体核黄素转运蛋白研究领域的部分空白。一方面，作为精子特异性表达的转运蛋白，SLC22A14 可以潜在地应用到以控制精子代谢为靶标的男性避孕药的开发；另一方面，对SLC22A14 的研究可为临床男性不育诊治提供理论依据。

清华大学药学院陈立功研究员为本文的通讯作者。药学院已毕业博士生匡文华为本文第一作者。实验室成员张杰、兰洲、马志龙、程丽丽、赵心彬、罗琪和孟子裔，新加坡A*STAR研究所范昊研究员、中科院动物所李卫研究员、清华大学医学院纪家奎研究员等为本项研究工作做出了重要贡献。

此项工作得到比尔梅琳达盖茨基金会、科技部重点研发计划、国自然基金委重大研究计划和北京市结构生物学高精尖创新中心的基金支持。

相关论文信息：

https://doi.org/10.1016/j.celrep.2021.109025