怎样快速而准确地阅读科学论文（5）——结果(2)

吴崇明 中国医学科学院药用植物研究所 chomingwu@163.com

接上文。通过对结果部分的各小标题进行阅读，我们从整体上了解了作者的研究历程和写作逻辑，对整个故事的梗概有了大体认识，好比从远处查看了一颗大树的总体形貌。下一步，我们需要对每个小标题的具体内容进行细读，领略大树的每一个枝叶。在细读过程中，我们的头脑中必须清楚地认识到，现在所读内容在整个论文故事中属于哪一个阶层，其意义和价值地位是轻还是重，这样才能避免自己迷失在各种繁杂的细枝末节之中。

阅读结果的细节，一定要结合图表进行理解，同时分析作者的叙述与其提供的图表数据是否相符，有哪些纰漏或者令人费解之处。

还以上篇PNAS论文《Chemoproteomics Reveals Baicalin Activates Hepatic CPT1 to Ameliorate Diet-induced Obesity and Hepatic Steatosis》为例。

（1）第一部分，讲述Baicalin在细胞内具有降脂活性。

这是一个引子，与全文的主要创新点关系较远，因此在阅读时，我们仅需要看清楚作者都提供了哪些证据，来证明Baicalin的细胞降脂活性即可。关键是理清作者的研究和叙述逻辑。

这部分，作者用了将近一半的篇幅描述了实验过程，如果我们对这个实验比较熟悉，可以一眼略过，只需要看清作者的关键实验条件即可（关于实验方法的阅读，在后续中会仔细论述）：实验对象（HeLa细胞）；造模剂（油酸:棕榈酸=2:1）；处理时间（24h）；检测方法（ORO染色）。这个方法是常规的，唯一需要关注的，是作者为什么用HeLa细胞，而不是其它细胞？

实验结果：我们要多关注数字，但不用记住数字，而是评价这个数值是高是低，是好还是坏。作者提供了Baicalin降脂的量效关系（主要关注图1B；12.5 uM起效，400uM达到最大值，此时药物毒性并不显著），并用多种手段对降脂活力进行了评价（ORO染色测吸光度；ORO染色拍照；ORO染色显微镜成像；和SRS显微镜，这些降脂表征方法可以作为我们的借鉴，学习用这些方法呈现我们的数据）；另外作者在小鼠肝脏细胞中对Baicalin降脂活性进行了确认（这可以回答我们上面的疑问）

总之，这部分不是论文关键部分，我们了解一下作者用了哪些方法，从哪些角度对Baicalin的降脂活性进行表征，这些表征数据是否足以支持Baicalin具有降脂活性的结论即可。

（2）第二部分，利用SILAC-ABPP技术寻找Baicalin的靶标谱

这部分作者讲述了所用方法的原理和具体过程。这是本文的一个亮点技术，如果读者对这个技术感兴趣，可以结合论文图片同时查阅相关资料进行精读，如果不感兴趣或者已经知晓，则只需要评判作者的操作过程是否有瑕疵即可。

第一段粗略阅读可以知道是在讲这个方法的基本原理，这段话中提到了三个重要名词，chemical proteomic（化学蛋白质组）、stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC)（细胞培养条件下的稳定同位素标记）和photoaffinity probe（光亲和探针）。如果读者对这个技术感兴趣，可以百度或者google搜索这三个关键词，快速了解其基本概念和基本原理。如果不感兴趣或者已经熟悉，则可以粗略读过，知道作者使用了这三种技术即可。

第二段作者主要介绍了实验的过程和所得结果。关键是结合图2C品读作者的操作过程，并记下关键参数：（1）SILAC标记获得轻重细胞；（2）1mM Baicalin孵育15min；（3）探针标记并进行光亲和反应；（4）蛋白与微球结合并分离；（5）消化蛋白并进行质朴分析；（6）通过竞争性结果，判断Baicalin的结合蛋白。其中作者如何判定哪些蛋白是Baicalin的结合蛋白，即第（6）步是读者需要理解的。

这部分讲述了一个技术，读者如果感兴趣就需要结合图片并查阅相关文献进行仔细阅读，如果不感兴趣，只需要知道作者采用了一种方法找到了142个潜在能够与Baicalin结合的蛋白即可。

（3）第三部分，Baicalin靶向脂肪酸氧化关键酶

这部分作者从142个潜在靶蛋白中聚焦到脂肪酸氧化关键酶。那么作者是怎么聚焦到这类酶的？其分析是否合理呢？这就是我们阅读这部分需要考察的内容。

第一句话，作者对142个蛋白进行了Gene ontology analysis（基因本体论分析），这是一个什么鬼？如果感兴趣可以查一下这个名词的具体含义，但即使我们不知道其确切意思，依然可以了解到，这个分析应该就是探寻这142个蛋白质的功能，隶属于哪个pathway。作者对这些蛋白的功能类型进行了归类，发现最可能的是脂肪酸降解通路（图E），恰好这个功能与观察到的降脂活性一致，所以作者随之聚焦到了脂肪酸氧化通路。

评价：从这个叙述我们得知，作者从142个蛋白中聚焦到脂肪酸氧化通路酶凭借的主要是推测，所以这一步的结果具有很大的偶然性，是很值得商榷的。首先，化合物与蛋白的结合应该是点对点，而非点对面，也就说，一个化合物主要结合一种蛋白质，而不太可能是同时与一个通路里的每一个蛋白酶都结合，所以作者按照蛋白所属通路的高低进行评判，并不完全令人信服。后续结果也显示，Baicalin对所鉴定酶的作用并不太强，也证明了这个推断方法存在缺陷。其次，做KEGG等分析是建立在蛋白的功能已知的基础上，用这个逻辑寻找靶点，大概率只能得到已知功能的蛋白，而会错过新功能蛋白靶点的鉴定，因此这样做可能会错过原始发现全新功能靶点的机会。

在聚焦了脂肪酸氧化通路之后，此时仍然还有7个候选蛋白。于是作者使用了逐个进行siRNA干扰的技术。发现只有CPT1A被干扰之后，Baicalin的降脂功效被大幅降低。进一步，CPT1A的抑制剂也可以削弱Baicalin的降脂功效。这是一个很关键的数据，终于将Baicalin的靶点最终聚焦到了CPT1A上。

评价：作者的叙述似乎很不错，很让人兴奋，但是也不能光听作者的叙述。对于这个数据，我们至少有两点考虑：（1）众所周知，CPT1A是脂肪酸氧化的关键酶，敲减CPT1A必然导致细胞内脂质代谢发生严重紊乱，而Baicalin作为一个黄酮类天然产物，其降脂效果较弱，所以当CPT1A被敲减之后，即使CPT1A不是Baicalin的靶点，也可能会掩盖掉Baicalin的降脂功效。（2）更重要的，基因敲减实验并不能确认CPT1A是Baicalin的直接作用靶点，而只能确认CPT1A在Baicalin降脂通路的下游。这是一个非常重要的实验常识。所以作者还需要有更多的数据来支持他们的结论。

（4）第四部分，Baicalin直接激动CPT1A。

前面的结果证明Baicalin可以结合CPT1A，但是这种结合的效果是激动还是抑制呢？其实从药效上看，我们就可以推定，一定是激动作用。于是作者提供了这方面的数据。这个数据属于可想而知的数据，不用太关注。不过既然是酶生化反应，我们就需要知道关键的酶促反应参数，如量效、时效、EC50值、最大效度值和特异性等。那么作者提供了这个数据了吗？

作者首先测定了CPT1A活性。（1）细胞实验：100 uM处理HeLa细胞24h使CPT1A活性提高3倍，但没有增加CPT1A表达量。（2）细胞裂解物实验：100 uM处理HeLa细胞裂解物，效果相似；（3）线粒体实验：单独提取线粒体测活性也一样；（4）异源表达人、小鼠和线虫CPT1A蛋白的大肠杆菌裂解物实验：原核表达CPT1A蛋白的大肠杆菌裂解物进行活性测定，也一样（这个实验应该用纯化的蛋白质，但作者无法得到有活性的纯化CPT1A蛋白，所以用这个方法进行替代），同时证明Baicalin激活CPT1A蛋白无种属差异；（5）Baicalin对CPT1B无激活作用，表明具有特异性。

评价：作者这部分的工作做得非常详细，一层套一层，层层深入，引人入胜，让人读着赏心悦目。

接下来，作者开始回答我们提出的关于酶促反应参数的问题。很可惜，他对此的回答非常模糊，而且把最关键的数据放到了Supplementary file中。可见他们对此的底气也很不足。总体上，这部分的工作做得不好。结合后面的数据，我们会发现，这其实是本篇论文最致命的弱点所在。

（1）首先，作者没有测量Baicalin的起效时间。如果是专属激动剂，应该很快就能看到激动效果，但作者没有提供这个数据，只提到处理24h有效，这个时间太长了。（2）Baicalin激动CPT1A的最大效度达到了20多倍，这个数据还是不错的。（3）但是，Baicalin激动CPT1A的起效浓度>100 uM，而在药理实验中，Baicalin在100 uM已经有很好的效果，此时Baicalin尚不能激动CPT1A，这个矛盾如何解释？（4）最关键的，EC50是247uM！这么高的浓度，换一个别的什么化合物或许也能够测到抑制效果吧？Baicalin当真是CPT1A的激动剂吗？真的很值得怀疑。

（5）第五部分，Baicalin激动CPT1A的结构模式。

虽然对一些结论心存怀疑，但是总体上作者的数据还是比较令人信服的，Baicalin应该是CPT1A的激动剂，至少CPT1A是Baicalin的其中一个靶点。那么Baicalin是如何激动CPT1A的呢？

首先作者证明Baicalin与CPT1A直接相互作用。前面的探针垂钓已经初步证明两者应该存在相互作用，但是这种相互作用是直接的还是间接的呢？最直接的方法是纯化CPT1A蛋白，然后通过SPR等技术看两者的结合常数。但是作者解释了，他们无法获得有活性的CPT1A纯蛋白，所以只好在细胞裂解物中进行变通试验——热迁移试验。这个数据其实很弱，所以作者必须提供更多的数据才能证明他们的论点。

于是作者再次用化合物探针方法寻找Baicalin与CPT1A的相互作用片段。这是一个非常耗时耗精力的实验，一方面可以作为证明两者直接相互作用的证据，另一方面也可以寻找CPT1A中与Baicalin结合的肽段（图C）。但我们要清楚，这种实验也只是间接的证据。这个竞争结合的原理是需要我们仔细理解的，在阅读时我们要仔细冥想。

根据结合肽段数据，作者利用软件包构建了药物与CPT1A的结合模式，并推定了几个关键的氨基酸残基位点。随后，作者构建了点突变的CPT1A，并利用探针结合实验证明突变后，两者的结合的确减弱了。虽然这个工作量非常大，但依然很可惜，依然是间接数据。

为了弥补间接数据的不足，作者下血本做了活性测定和互补实验。结果都证明，上述四个位点是Baicalin激动CPT1A的关键氨基酸位点。

评价：虽然没有直接的证据，但是作者通过大量不同的间接证据，证明Baicalin与CPT1A的直接相互作用，并确认了关键氨基酸结合位点。这部分工作做得真的很好，数据真的很丰富，但可惜的是，效果真的很弱，总也无法排除我在前面提到的各种疑虑。

（6）第六部分，Baicalin体内缓解代谢疾病。

到此部分，作者将研究从体外细胞学转向了体内动物水平。和第一部分一样，这是为揭示Baicalin体内作用机制做的铺垫性研究。不是很重要，只要了解，Baicalin在动物体内依然有效即可。

（7）第七部分，激活CPT1A是Baicalin发挥减肥作用的关键机制。

此部分，作用要揭示Baicalin发挥降脂功效的体内作用机制。或许读者会问，既然细胞实验已经详细证明了，CPT1A是Baicalin发挥降脂功效的关键靶点，为什么还要在体内证明呢？我想至少有以下几点原因：（1）细胞实验是体外操作，人为的影响比较大，因此体外试验的结果需要在动物体内进行验证；（2）细胞实验结果只能证明对于所用细胞（如宫颈癌上皮细胞和小鼠原代肝细胞）有效，而动物是一个多种类细胞的整体，一种或几种细胞类型得到的结果不能等同于动物的整体；（3）细胞实验是一个条件较为单纯的实验，在动物体内，除了细胞本身之外，还存在神经调节、体液调节、内分泌调节等等，当细胞置于复杂的调控网络时，其体外表现可能无法体现真实的体内情境。基于以上的考虑，所有体外试验结果都需要在体内进行验证。

那么作者是如何进行体内验证的呢？

作者首先介绍了CPT1A的H327E突变体，说它不能与Baicalin结合，也不能被Baicalin激动。作者交待这个有什么用意呢？原来证明蛋白是药物功效的关键靶点的最常用的方法是构建遗传突变小鼠，将CPT1A敲除，然后考察药物的疗效是否被削弱。但是从第二段第一句话可以得知，CPT1A的敲除导致胚胎死亡，所以他们没有能够成功。（评价：全身敲除不行，为什么不用组织特异性敲除？比如肝脏或骨骼肌敲除；或者为什么不做可诱导性的敲除，在做实验时利用诱导剂诱导CPT1A的敲除？作者没有做还是做了没有成功？）

Anyway，作者于是采用了变通方法，首先利用shRNA敲减技术，观察肝脏的效果，结果与预期相符，CPT1A敲减导致Baicalin功效消失。进一步，作者在敲减的基础上进行了互补实验，此时使用了野生型和H327E突变体，发现野生型可以恢复Baicalin功效，而H327E突变体不行。这是一个非常关键的数据，说服力很强。综合基因敲减和功能互补两方面的数据，提供了可信度很高的结果。通过以上证据，证明激活CPT1A是Baicalin发挥减肥作用的关键机制。

总体上讲，作者的数据很丰富，可信度也比较高。但是，他们在药物剂量上吃了很大的亏，由于Baicalin的EC50值过高，导致其结论的可靠性存在一定的疑问，不能不说是很可惜！

这样，论文的结果部分我们就阅读完了，在欣赏了作者的精巧设计的同时，也得到了一些研究技巧，更重要的，我们对论文的研究思路、叙事逻辑和方法学做出了自己的评判，虽然不一定全部正确，但有助于我们的思考。在我看来，这篇工作的最大的问题在于：脂肪酸氧化通路的聚焦有些草率，导致虽然在CPT1A上做了巨大的工作，但Baicalin对这个酶的功效并不很明显，很有可能CPT1A并非Baicalin的关键靶点。在CPT1A的上游，可能存在Baicalin的其他靶点，这值得深入去挖掘。