全脑显微光学成像，探秘“大脑地图”

封面解读：封面展示了利用光学成像方法在小鼠全脑范围内以微米分辨率绘制神经环路精细结构的示意图。光学成像方法在横向上能够达到亚微米分辨率，并可通过多种手段实现“光学切片”的效果，具有在介观水平观测神经环路的天然优势。各类自动化全脑显微光学成像方法将光学成像与组织透明化或机械切削相结合，突破了光学成像在生物组织中的成像深度限制，具有在大范围内实现介观水平精细观察的技术优势。结合各类生物样本荧光标记技术，全脑显微光学成像方法已成为剖析全脑神经网络的最佳方式。

原文链接：江涛, 龚辉, 骆清铭, 袁菁. 全脑显微光学成像[J]. 中国激光, 2023, 50(3): 0307101

显微光学成像，解析神经环路精细结构

大脑是自然界最复杂的系统之一，是生命诞生数十亿年以来进化的巅峰。由于对脑的结构和功能缺乏认识，导致对精神分裂症、癫痫、阿尔兹海默症和帕金森氏病等神经系统疾病缺乏有效的干预药物和治疗手段，脑疾病已经成为社会负担最重的病种。

脑的强大功能源于其数量巨大的神经细胞及其复杂的相互联接。神经环路是由大量不同神经元有机组合形成的、实现特定信息传递与处理的结构功能单位，是实现脑高级功能的基本单元。神经元是神经环路的基本组成单元，人脑中约有860亿个神经元，而作为神经科学研究中经典的模式动物之一：小鼠脑中约有7000万个神经元。神经元突触的大小仅约1 μm甚至亚微米，典型神经元胞体的直径约为10~30 μm，神经纤维的直径仅为亚微米至1 μm；而神经元的树突可覆盖局部数百微米的范围，轴突的长度则可延伸至更远的位置甚至达到全脑范围。因此，脑神经联接结构的研究同时具备了大范围和跨尺度两个特点，就像绘制一本世界地图，既需要覆盖世界范围，又需要精确到每个国家的基层路网等局部细节。

“脑地图”的绘制已经有一百多年的历史，从1906年的诺贝尔奖得主、西班牙科学家Cajal绘制神经细胞图谱（奠定了现代神经科学的基础），到德国解剖学家Broadman将大脑划分为了52个不同的区域，再到20世纪后半叶于利希研究所把人脑划分为120多个分区，都极大地促进了脑科学研究的发展。2009年美国启动了基于功能磁共振成像技术的人脑连接组计划，2016年又启动了基于电镜技术的大脑皮层网络的机器智能计划（也称大脑“阿波罗计划”）。这些都是对“绘制脑地图”的尝试，但它们都尚不能在全脑范围内展示出单个神经元的精细结构。

获取全脑精细地图的利器有哪些？

“工欲善其事，必先利其器”，针对小鼠等模式动物的全脑介观神经联接图谱绘制，需要有能够实现规模化地获取全脑尺度范围高分辨率三维数据的技术工具。光学成像方法的横向分辨率可达亚微米的水平，能够分辨胞体、轴突和树突等结构，具备观测神经环路精细结构的天然优势。同时，通过共聚焦、结构光和双光子激发这类“光学切片”技术能够方便地实现层析成像。但由于生物组织对光的散射和吸收，导致这些传统光学方法的成像深度有限，仅能对鼠脑浅层数十微米至数百微米部分进行成像。为了突破光学成像方法在生物组织中成像深度的限制，实现高体素分辨率和大范围的三维探测，光学显微镜必须和组织学方法结合起来（如图1所示），以实现全脑范围精细结构的三维重现。

图1 全脑显微光学成像的技术路径

（1）基于组织透明的全脑显微光学成像方法

该成像方法是指先将生物组织进行光透明化处理以提升光学成像深度，然后再用光片照明显微镜（LSFM）进行快速成像的技术。生物组织对光的散射是由于不同部位的折射率不一致所引起的，例如细胞膜中脂质的折射率明显高于细胞内外的水分，光在穿过细胞膜时就会产生散射现象。因此，为实现样本的光透明化，需使得样本内各部分的折射率一致。早在20世纪初，Spalteholz就发明了一种利用有机溶剂使得完整器官变透明的方法。近些年来出现了大量的组织透明处理方法，通过不同的手段来减少光在组织中的散射，从而实现样本的光透明化。

图2 光片照明显微镜原理图

在对样本进行光透明化处理后，可利用LSFM实现对鼠脑等大尺寸样本的快速成像。LSFM与传统显微镜有着显著的区别，在LSFM中照明光路和探测光路是分开的：照明光路形成薄片状照明光从侧面照射样本从而实现选择性的荧光激发；探测光路的物镜光轴垂直于照明光片，物镜的焦面与光片重合，保证照明光片中所激发的荧光信号被物镜收集，并最终被面阵探测器所记录。与传统显微镜相比，LSFM具备良好的光学层析能力，能够极大程度地减少非必要荧光激发，并能够以以数微米的体素分辨率实现快速全脑成像。

（2）基于机械切削的全脑显微光学成像方法

该方法是将光学层析成像技术与组织切削技术相结合：每次扫描获取整个样本断面浅层部分的层析图像后，利用刀具切削掉样本表面已成像的部分，通过不断循环“样本断面成像-切削”过程，即可实现对厘米尺寸大样本的三维精细结构信息获取。这种技术方案的优势在于成像位置始终处于散射较低的样本浅层，可保证大尺寸样本整体均匀一致的成像质量。此种技术方案的代表包括双光子序列断层成像（STP）技术、块表面序列成像（FAST）技术和显微光学切片断层成像（MOST）系列技术。

STP技术将高速双光子成像与振动切片技术相结合，利用双光子点扫描成像以马赛克拼接方式获取样本浅层部分的层析图像，随后通过振动切片去除表层已成像的样本组织，一般的典型应用为轴向数十至百微米的间隔采样成像。FAST技术同样采用琼脂糖包埋方式并利用振动切片机实现快速切片，不同之处在于FAST采用转盘共聚焦实现对浅层组织的层析成像，能够以0.7×0.7×5 μm3的体素采样率在2.4 h内完成小鼠全脑单色成像。MOST系列技术将完整脑样本包埋制备、显微光学成像和自动化精密切削技术相结合，形成了独具特色的技术体系并持续不断地发明新技术新工具。MOST系列技术为全脑介观神经联接图谱绘制提供了在全脑样品的全部空间中遍历每个像素的高分辨率光学成像方法，所采集的数据集均表现出数据完整性、三维可重建性、分辨率高和数据质量好等特点，可以对神经元完整形态、神经元分布、血管网络等解剖结构在精确定位下进行定量的形态学分析与比较。

图3 基于机械切削的全脑显微光学成像方法原理图

总结与展望

这些全脑显微光学成像新兴技术实现了前所未有的分辨率、成像速度和成像范围，极大地促进了全脑介观神经联接图谱数据的的采集与分析，为神经科学领域开启新篇章，但因其复杂性，面向完整全脑的研究还有待进一步探索，还需同时发展样本标记与制备、海量数据存储处理与可视化等方法。另外，对于人脑高级功能和相应药物的研究，目前采用的啮齿动物样本有明显局限性。非人灵长类作为与人类最为接近的物种，对于研究人脑的认知行为、疾病机制和治疗手段有着极其重要的价值。但猴脑的研究难度远大于小鼠脑：小鼠脑的重量仅为~0.42 g，神经元的数目为~7000万；狨猴脑的重量为~7.78 g，是小鼠脑的~20倍，神经元的数目为~6亿3000万；而猕猴脑的重量更是达到了~87.35 g，是小鼠脑的~200倍，神经元的数量为~63亿7000万。因此，非人灵长类的脑研究对于样本标记制备、成像技术和大数据处理等方面均提出了极大的挑战，之后的研究必须更加系统并多学科交叉。

在与生物、机械、电子、工程、化学、计算机等多领域的跨学科合作中，全脑显微光学成像技术将进一步蓬勃发展，在脑科学中展示其独特的应用价值，共同完成绘制介观脑联接图谱的奋斗目标。相信这一宏大研究计划的实践，将极大促进我们对脑的认识和理解，助力人工智能技术的发展。

课题组简介

骆清铭院士团队砥砺奋进20年，坚持“光电、机械、生物、材料、数学、计算机等”多学科协同攻关，拥有全链条“样本标记制备、三维高分辨率全自动成像、大数据处理与分析”的自主知识产权。2010 年在 Science期刊发表全脑显微光学切片断层成像技术（MOST），独辟蹊径地将完整脑染色包埋、显微光学成像和自动化精密切削技术相结合，首次建立了能够对数厘米大小的样本获取亚微米分辨水平的MOST技术，形成了独具特色的技术体系。从此，该团队在全脑介观神经联接图谱绘制技术研发方面，持续不断地发明新技术新工具，保持一路领先的业态。发展了三维高分辨荧光显微光学切片断层成像方法 fMOST（NeuroImage, 2013），国际同行在 Nat Methods评价“是开创性的工作，实现了单根轴突的长距离的追踪”；高通量荧光层析和实时在线染色的双色成像方法dfMOST（Nat Commun, 2016），国际同行在Nat Rev Neurosci 评述“dfMOST技术能够实现轴突分辨水平的成像和单个遗传标记的神经元在细胞分辨水平的空间配准”“标志着小鼠全脑高分辨、定量化、规模化的单神经元解剖学的崛起”；高清荧光显微光学切片断层成像 HD-fMOST(Nat Methods, 2021)，将全脑光学成像从高分辨率提升到高清晰度的新标准，入选“2021中国光学十大进展”应用研究类。

通信作者简介

袁菁，华中科技大学武汉光电国家研究中心教授，现为中国光学学会生物医学光子学专委会常务委员，《中国激光》青年编委。长期从事器官尺度高分辨率三维光学成像研究，是MOST团队仪器研发方向技术负责人。近五年以一作或通讯（含并列）在Nat Methods、Nat Communications等学术期刊发表论文15篇，授权发明专利30余项。曾获2021年度黄家驷生物医学工程奖技术发明一等奖（排名4），发明的线照明调制显微术及高清荧光显微光学切片断层成像技术入选2021年度中国光学十大进展，入选《国家自然科学基金资助项目优秀成果选编》。 E-mail: yuanj@hust.edu.cn