光损伤：多光子成像中的“过犹不及”

封底解读：封底呈现了生物组织多光子成像中典型的光损伤景象，在一段小肠上皮细胞的双光子荧光图像中观察到非常明亮的超荧光。以放大图的形式展示了光损伤微观机制：飞秒激光与水、生物分子相互作用时产生自由电子、羟基自由基、单线态氧等活性氧成分，光氧化和低密度等离子体介导的光化学作用引起光损伤。背景二进制代码代表了用到的数学模型和计算机程序。光损伤决定了所能使用的激光功率的上限，降低光损伤是多光子成像的一大挑战，光损伤研究对于优化成像参数至关重要。

原文链接：梁晓轩, Alfred Vogel, 张镇西. 多光子成像中的生物组织光损伤[J]. 中国激光, 2023, 50(3): 0307102

1、背景介绍

多光子成像技术是一种实时观察细胞亚结构的成像“利器”，它的成像深度可达1 mm，能够观察到深层组织的细胞活动，甚至监测它们的生化代谢。多光子成像技术主要包括双光子及三光子成像，前者使用波长约800 nm的飞秒（10-15 s）激光，在细胞或浅层组织成像中使用广泛；后者使用波长约1.3 μm的飞秒激光，在深层组织成像中得到越来越广泛的应用。多光子成像技术自问世以来便在肠道疾病、癌症病理、神经疾病及脑功能成像等方面取得了一系列研究成果，成为生物医学研究的有力工具。

由于生物荧光团分子的多光子吸收截面很小，因此需要很高的激光辐照度才能得到足够强度的多光子激发。过小的激光功率难以获得足够信息的荧光图像，而使用过高的激光功率会引发细胞和生物组织的光损伤，造成多光子成像中的“过犹不及”。因此，一个合理的激光功率既要保证能获得足够信息的荧光图像，又要保证细胞或生物组织在长时间照射后依然保持正常功能和活性。降低光损伤和优化成像参数是多光子成像中的一大挑战，光损伤研究对优化成像参数至关重要。

2、光损伤基本原理

在双光子荧光显微镜中荧光团产生的荧光强度（光子密度nph）与激发光的辐照度呈二次方关系，如图1虚线所示。激光辐照度或激光功率越高，荧光团发出的荧光强度越大。然而，随着激光功率的提升，荧光强度虽然得到提升，但是生物组织中的水开始被电离。生物组织中的含水量约为70%，而水在常态下可近似为一种电离能约为6.5 eV的透明电介质。随着激光辐照度增大，液态水开始通过多光子吸收效应被电离，形成自由电子。自由电子密度ne与激光辐照度约呈五次方关系，如图1实线所示。

由于非线性吸收阶数不一样，双光子荧光在较小辐照度下就可以产生，但是荧光强度随激光辐照度增长相对缓慢；相对而言，水中自由电子激发是5光子吸收，需要较高辐照度产生，但是自由电子密度随激光辐照度增长相对较快。两条曲线在辐照度约为2×1012 W/cm2处相交，此时每产生一个荧光光子就会产生一个自由电子。由于自由电子可以破坏生物分子的化学键，造成生物分子损伤，因此有学者将其称为电离“惩罚”，并将ne/nph = 1时对应的辐照度定义为光损伤发生的阈值，为光损伤提供了一个直观易懂的概念。

图1 多光子生物成像中的电离“惩罚”

3、光损伤类型

1） 无色素组织双光子成像中的光化学损伤

学者们将不含有黑色素的组织定义为无色素组织，比如小鼠肠道上皮组织，这类组织对光的线性吸收能力很弱，几乎不会通过线性吸收产生热量。在对小鼠肠道上皮组织进行双光子成像时，学者们观察到使用平均功率为20 mW的飞秒激光可实现无损成像，并可对同一组织连续观察8小时，如图2(a)所示。图中可以清晰的观察到杯状细胞（goblet cells），上皮细胞边界及其发出的自发荧光，这些荧光主要来自于线粒体中的NADH。当激光平均功率增大为38 mW时（约为无损成像功率的2倍）可以明显观察到光损伤。如图2(b)中黑色箭头所示，对同一视野区域重复扫描多次后，观察到某些上皮细胞中出现明亮的超荧光，其荧光强度约为无损成像时荧光强度的40倍。超荧光一旦开始其荧光强度迅速增加，之后超荧光区域迅速演变为黑斑，如图2(c)中红色箭头所示所示。经理论模型分析表明无色素组织双光子成像中光损伤主要由光化学作用介导。

图2 小鼠肠道上皮细胞双光子成像及光损伤。成像参数：脉宽100 fs，波长730 nm，重复频率80 MHz，激光平均功率：无损成像功率20 mW，光损伤功率38 mW

2）色素组织双光子成像中的光热损伤

与无色素组织对应的为色素组织，如视网膜和皮肤，它们含有大量黑色素，其线性吸收能力很强。学者们使用1.6 mW的飞秒激光对小鼠视网膜切片进行双光子成像，可清楚观察到光感受器外段（OS）、视网膜色素上皮层（RPE）和脉络膜（Choroid）等视网膜结构，如图3(a)所示，其中粉色箭头表示RPE和脉络膜边界。当激光功率增加到3.5 mW时观察到明亮荧光点，表明出现一定程度的光损伤，如图3(b)中白色箭头所示。在扫描7.2 s后明亮荧光点数量增多、亮度增强，同时还观察到明显气泡或组织损伤的部位，表示强烈光损伤，如图3(c)中红色箭头所示。在3.5 mW激光扫描停止后明亮荧光点并没有立刻消失，如图3(d)中黄色箭头所示。视网膜中出现光损伤阈值（3.5 mW）比无色素的肠道上皮细胞阈值（38 mW）低约10倍。这种差别的关键原因在于视网膜中黑色素强烈的线性吸收特性，即便在红外波长750 nm下吸收系数依然高达μa = 3000 cm-1。经理论模型分析表明色素组织双光子成像中光损伤由光热作用主导。

图3 小鼠视网膜冷冻切片双光子成像及光损伤。成像参数：脉宽75 fs，波长750 nm，重复频率80 MHz，激光平均功率：无损成像功率1.6 mW，光损伤功率3.5 mW

3）三光子深层组织成像中的光化学、光热协同作用

在深层脑组织成像中三光子成像比双光子更有优势，因为三光子对应的红外波长（≈ 1.3 μm）比双光子对应波长（≈ 800 nm）在浑浊生物组织中穿透深度更大。由于脑组织对光的散射，光强随深度呈指数衰减特点，对1 mm深层脑组织三光子成像时往往需要使用≥ 100 mW的高激光功率，这会诱发脑组织光损伤。如图4所示，学者们使用不同功率激光对脑组织进行三光子扫描，然后用免疫组化法分别检测了热休克蛋白（HSP）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和Iba1的荧光变化，发现在0~100 mW激光照射时脑组织免疫荧光没有明显变化，但在150 mW时观察到脑组织边缘位置荧光明显增强（白色箭头所示），表示出现了光损伤。有学者分析1320 nm处水的吸收系数μa = 0.14 mm−1不能忽略，线性吸收引起脑组织中最高温度可达41°C，这一温度有可能引起脑组织热损伤。另一些学者分析表明该脉冲能量下激光辐照度依然高达2×1012 W/cm2，会诱发低密度等离子体，其引起的光化学作用也很可能诱发光损伤。因此，在三光子深层组织成像中光损伤很可能由光化学、光热协同作用引起。

图4 不同功率下三光子激光连续扫描小鼠脑部20分钟后免疫标记切片。成像参数：脉宽60 fs，波长1320 nm，重复频率1 MHz，成像深度 1 mm，激光平均功率：无损成像功率100 mW，光损伤功率150 mW

4、总结与展望

通过对不同组织、不同波长下光损伤的讨论和分析，可以总结出光损伤的一般性规律，在无色素组织双光子成像中光损伤以光化学作用为主、在色素组织双光子成像中以光热作用为主、在三光子深层组织成像中光损伤很可能来自于光化学和光热协同作用。将光损伤阈值数据库、传统优化模型及机器学习相结合可以成为实现在线、自动、多组织、多深度成像参数优化的一个新发展方向。

通信作者简介

梁晓轩，德国吕贝克大学生物医学光学研究所研究员，中德联合培养博士。主要从事生物组织光损伤、激光等离子体、激光微纳米手术和空化气泡等领域的研究工作。在Optica、PNAS、Photonics Research、Optics Express、Physical Review B及Journal of Fluid Mechanics等杂志发表多篇学术论文，由Springer和Wiley-VHC出版数篇书章，多次在国际会议上做特邀口头报告。担任《中国激光》“生物医学光学”专题子刊青年编委，是Optica学会以及“留德中国物理学者学会”会员。是Journal of the Optical Society of America B、Journal of Laser Applications、Physics of Fluids及《中国激光》等期刊的审稿人。作为骨干成员参与多项中德国际合作项目、德国研究联合会和美国AFOSR项目。