原代建系更新参考 组织-细胞要点

1：离体处理，建议手术刀并排两三个固定后，冰上最快速度处理，建议十分钟内入皿。

2：不管哪种培养体系，都要有一组含血清，这个每个实验室都很熟悉，上清前几代留着，后面建系中，细胞受损后救助（冻存复苏，长期培养驯化过程中细胞状态差等救助），类器官，无血清方案两年统计结果给出含血清参考。含血清优势是可行，每个实验室都熟悉相关足够的经验与问题解决，还可先成功，大量细胞拿到，有充足的细胞后，在评测无血清。

3：冻存复苏：建议两指厚面包裹后直接负80后，第二天液氮，有泡沫冻存盒裹在棉花外面效果更好，建议平时冻存复苏评测。较挑剔的有免疫细胞，原代等测试效果比较好，无血清方案，建议新式冻存方法评测比较。

4：建系病毒要点：高滴度。

5：技巧参考：要对细胞镜下形状熟悉（或者先筛选目的细胞有个大概判断后），可不用分离液，流式等前期筛选，单克隆多做些，等大量培养后在做相关检测，避免分离液化学损伤，流式机械损伤而使细胞建系培养不顺利问题。大大提升成功率，上述1-3是组织到细胞，4是难感染细胞痛点，要能理解上述要点，重复实验容易并可行，也是建系简单重复关键。

组织-细胞    细胞-组织   难养细胞系参考统计，上皮，SV40 （原代要熟悉培养特性，正好与难养系长满传代时间一致。）缺氧培养应用优势整理中，缺氧培养优势是成干后，细胞分化控制目的（相关文献建议看成干后动物模型验证）

6：传代培养注意：千万别按细胞系传代习惯，总是拿出来开看细胞（这点尤为重要，关乎成败）建议多放50%完全培养基后，4-7天传代合适，成纤维，内皮，上皮首代消化费劲，建议考虑组织-细胞处理步骤影响的组织活性，例如操作步骤全程冰上，快，（消化液选择不合适，时间过长等因素），树突，kuffer，难消化建系工业用途可来信告知，这类我们可试完成建系难点痛点建系（我们拿技术换口饭吃）

SV40建系培养特点，细工技术储备充足（国内建系做技术储备），如您建系也用SV40,如遇到问题，可讨论。问题结合统计有些共性，也有组织特性，可讨论。

人肾皮质近曲小管上皮细胞；HK-2    人乳腺上皮细胞；MCF-10A     人肺正常上皮细胞BEAS-2B     人肝癌细胞；Hep G2 [HepG2] 上皮样      人胚肾细胞；293 [HEK-293] 上皮样   人脑星形胶质母细胞瘤；U-87 MG [U87MG；U87 MG] 上皮样

后期相关问题统计

维持培养：维持培养验证建系，种子库等重要实验试剂筛选推荐，细工内部应用维持培养，在高产蛋白，培养基血清试剂评测种子库，生产应用做技术评测，外泌体应用，噬斑工业应用都取得了不错的效果。

控制分化：缺氧，成干，维持培养应用后续在统计讨论

离体后开关通路（细工优化胰酶解决这个问题，胰酶经过各种胰酶敏感细胞系长期统计筛选，胰岛胰腺类细胞系），也是离体后首代培养关乎成活关键。

细胞痛点讨论及参考-系验证可行性，原代应用有理由

问题关于黑点

细工建议参考，用对试剂耗材（种子库级别细胞不建议用便宜试剂，保种上百只种子细胞，也用不了多少钱的）胰酶轻柔处理（避免枪直接吹打细胞损伤也是较重要指标参数），几代或十几代后，黑点会全部消失。这个建议也只是救助办法参考建议，经历过黑点的细胞，建议重新保种国内正规库来源细胞。

问题细胞系生长慢-原代生长慢-细胞养几代后就爬爬这种情况

细工建议参考 给出方案是进口瓶培养（康宁，nunc,德国产细工全部现货） ，种子库级别试剂（三千以上胎牛，我司验证五年以上南美）我司培养基或者是GIBCO培养基，放足培养基（多些也没关系）几天不动，看下恢复情况，结合我司胰酶（无损消化）传几代应该能找回较好状态，该方法也适合细胞养几代后就爬爬这种情况（上述方法也适合细胞养传代后细胞就爬爬这种情况，该因素原因很多，具体情况集体分析）该方法也建议原代首代培养（类器官）就是普通培养基加胎牛（因子贵，lag phase长、无血清不稳点）全部能替代，细胞够多或稳定后在上无血清可做参考。类器官配套耗材U型低（不加辅助条件成球）及磁珠配套磁力成球可来信告知索取资料及技术讨论。

成瘤不稳定组参考，细胞培养分化控制

瓶，慢养慢传代慢生长，无损胰酶，少二氧化碳，减缓生长，减缓分化，理由：来自成干成球培养，难养细胞株痛点统计规律相似特点。分出一批评测，操作更简单，给成瘤不稳定组，提供一组备份条件，从成干特点上看（缺氧培养减缓细胞分化-这个特点又能起到明显作用后，我们可能考虑离体后巨噬培养看看能否控制细胞分化，后面给生产型用户做些技术储备），优势挺大的，也给出一套备份技术储备。该方法只来自细胞救助案例，救助结果还比较理想，成瘤率逐步偏低是很多实验室遇到的问题，也是了解培养习惯统计后，提出该方案，如验证有效拓展应用，可考虑以下优化应用，北医白凡老师，生物物理所-李翀老师，10-1000个细胞成瘤五六年前文献可查下，完成上述验证，一瓶25培养瓶可接种几只动物，从成本上可大大降低培养中血清成本，并在采购血清，基质胶等上用到最好级别试剂并大大减少细胞培养成本。（北京实验室需合作验证可来信告知或讨论细节痛点，例如4-7天长满后，处理容易成团成片，传统处理方法就会影响细胞活性，胰酶相关问题统计了有五六年，对胰酶敏感的系或原代，都有不错的表现，SV40建系都容易成团成片。下一篇详细介绍各类成团成片特点，并在冻存复苏验证，转染应用都会有明显效果。

成干验证，减血清，增长速度很有参考意义。更多分化延展。

当单一的畸胎癌细胞种植到胚胎上时可以长成良性组织(Kleinsmith and Pierce，1964)，这提示在转化的细胞中表型改变是可逆的。

以至诱导分化经常被推荐作为肿瘤治疗的模型(SpremulliandDexter, 1984;Freshney,1985;Marks and Breslow,2007;Piccirillo et al.,2006; Wang et al.2008:Kangetal，2014)。