The Apostasia genome and the evolution of orchids

Affiliations: Shenzhen Key Laboratory for Orchid Conservation and Utilization, The National Orchid Conservation Center of China and The Orchid Conservation and Research Center of Shenzhen, Shenzhen 518114, China

先附一份刘仲健教授在“深圳拟兰基因组与兰花的进化”重大科研成果新闻发布会的演讲稿镇楼

刘仲健：尊敬的庆生常委，各位领导，新闻界朋友，现在我介绍一下深圳拟兰基因组和兰花进化的研究成果主要的概要。大家看到了，兰花具有非常多的多样性，各种形态和颜色，种类非常多，大概有880属近3万种，占开花植物物种的10%，全部野生兰花都是受《国际贸易公约》保护。

　　兰花还有一个特点，它几乎栖息于世界全部生境，陆生、附生、腐生的生活习性，能够适应不同的气温、温度与光照条件。达尔文提出进化论后，迫切需要一个模式性的类群来验证物种起源的假说，所以他选择了兰科植物。并于1862年首次出版了Fertilisation of Orchids。但是有两个问题一直困扰着他：为什么兰花物种数量如此丰富，兰花的花怎么进化而来的。

　　达尔文提出兰花进化假说，他认为自然选择的理论使兰花很高的物种多样性是由于多样、多种的传粉者塑造而成。他认为是传粉昆虫与兰花之间的相互适应推动了兰科植物成种。同时达尔文就花结构起源提出了同源性解说，他认为兰科植物应该是最早的“假”兰，就是我们今天说的拟兰，具有独立分开的雌蕊、雄蕊结构，没有被修饰过的花被片，散生的花粉块。

　　所以达尔文猜想认为兰科植物花的结构进化方向应该从简单到复杂，从辐射对称到两侧对称，雌蕊和雄蕊从离生到合生。为了验证达尔文这个猜想并解决困扰世界150多年的难题，深圳拟兰是理想的研究材料，深圳拟兰与“真的兰花”相比，它具有原始的性状，接近于达尔文推测的假兰。具有辐射对称的花被片、无特化的唇瓣结构、雌蕊、雄蕊分离、花粉散生为粒状，植株地生。所以开展深圳拟兰基因组测序研究工作，能够使我们从分子角度解开困扰科学家一个多世纪的重要难题。

　　我们对深圳拟兰进行测序，采用了新的技术，是二代、三代和10×genomics数据进行混合组装，同时大样品对五个亚科的代表物种进行转录组和非兰科植物相近的物种用于功能分析。我们今天给大家提供的分析结果就是三个兰花的基因组和100多个转录组，包括验证、功能分析。

　　通过新的技术，我们取得了非常高质量的组装结果。同时也对我们组装结果的编码蛋白做了注释分析，拟兰有21841个编码蛋白。也得到了转录数据的支持，证明了我们组装是非常高质量。

　　这是通过分析和研究，我们发现现在的兰科五个亚科共享了一次全基因组复制事件，也就是说现存的兰花祖先在6600万年前大灭绝事件发生之前发生了一次全基因组复制事件，是为兰科植物增加了多一套基因，开启了现今兰花的起源。

　　这就是我们通过全基因组复制事件，解决了兰花是怎么起源的，这一点是我们这里一个重要的发现。

　　而基因组这个复制事件以后，他很快分化成五个亚科，帮助了兰花的祖先躲过了第三次生物大灭绝事件，并通过基因的收缩域扩张，迅速适应了新的生态环境。因此我们现在所看到的兰花都是恐龙灭绝时期幸存下来的兰花的后代。由于大灭绝事件对很多的物种都灭绝了，留下了很多空间，所以兰花抓住了这个空间，迅速的占领了世界的生境。

　　同时我们发现了兰科的祖先基因工具包与基因池，兰科植物是有474个特有的基因家族，这个就是重建了兰科植物基因家族进化的历史和相关性状的分子机制，这就是兰花怎么来的，哪些基因控制的，它的工具包被给我们找到了。

　　同时揭示了兰科植物繁殖器官的起源与进化，它都是由MADS-Box基因控制，通过对蝴蝶兰、拟兰、水稻的相关基因分析，锁定了控制繁殖器官性状的关键基因。一个是合蕊柱与唇瓣的进化。唇瓣的进化是兰花进化里面一个里程碑式的进化，他使得兰花变成两侧对称，来适应昆虫传粉。增加了传粉的准确性。同时这个发现也修正了人们对兰花的进化或者对物种的进化由辐射对称向两侧对称这个认知，使兰花从两侧对称向辐射对称演化。

　　同时MIKC*与花粉的发育相关。除了拟兰以外的兰科植物中丢失，使得花粉粒从分离向黏连转变，这是兰花进化史上一个关键的创新。花粉块的进化，降低了后代的差异，使得群体同质性。花粉快只能是个体之间传播，而使得基因流传播受到隔离，推动了物种形成。

　　种子从有胚乳向没有胚乳的进化，主要是这个基因缺失了Mβ同源性基因，使得兰花的种子缺乏胚乳，使得它可以非常远传播，并且可以落在树干上或者石头上进行生长。

　　同时我们发现兰科植物，拟兰或者跟水稻对于地生的兰花和长在石头、树上的兰花的根的分化，由于缺少了AGL 12这个基因。并且ANR1基因收缩，使得兰花从地生向附生转化。通过根的变化吸收空气中的水分来使得自己在这样恶劣的环境下生存，环境的差异也促动的物种多样化形成。这个是通过基因我们也解决了这个问题。

　　主要贡献有四个方面：

　　第一，揭示了兰科植物的进化历程，解决了百年来困扰着达尔文和科学界的疑惑：起源后发生的一次全基因组复制事件帮助其躲过了大灭绝事件，其后快速多元化，通过特殊的形状特征占领了生态位，增加多样性。

　　第二，突破常规认知花从辐射对称向两侧对称的进化，由简单向复杂进化，兰科从全基因组复制事件后形成“真”兰花，随后由于部分基因丢失，形成“假”的兰花，从两侧向辐射对称，花的器官从复杂向简单进化。

　　第三，作为兰科植物工具包直接用于演化、资源保护和分子生物学领域研究，识别出控制核心性状关键基因，可以为分子育种提供关键的靶点。

　　第四，对于推动兰花相关产业链发展，提高我们在生物学、生物多样性领域研究水平具有重要意义。

　　通过这次的成果发表，我们可以看到第十九届世界植物学大会刚刚在深圳顺利成功举办，给世界展示了深圳的力量。在这个研究成果发表之际，我们已经开展了深圳香荚兰、兜兰、墨兰、血叶兰等兰科植物测序分析工作，给基因组数据带来更多更前沿的研究成果，全面展示深圳的科技创新能力，为深圳植物学研究领先地位打下基础。

Abstract

兰科植物约占有花植物的10%，其具有独特的花形，能够在不同的生境下繁衍生息，几乎遍布全球。本文对深圳拟兰进行了全基因组的测序工作，该植物属于兰科五个亚科中的拟兰亚科，为兰科植物祖先基因组序列的推断提供参考，帮助理解其起源与进化。另外，作者对香荚兰亚科、杓兰亚科及兰亚科的代表物种进行了转录组测序，并对树兰亚科的两个物种进行了三代基因组测序，因此作者的分析涵盖了兰科植物的所有亚科。深圳拟兰基因组中检测到了一次全基因组复制（WGD）事件，该WGD是所有兰科植物所共享的，并且发生后不久兰科植物开始分化。通过比较深圳拟兰和其它兰科植物和一些被子植物的基因组，作者重建了兰科植物的祖先基因。作者鉴定了MADS-box类基因的新的基因家族、基因扩张与收缩等，这在兰科植物的进化过程中控制着一系列的发育进程。本文的研究结果为兰花某些关键性状提供了遗传学基础，比如唇瓣、蕊柱、花粉、无胚乳种子以及附生习性的进化，同时也揭示了不同兰科植物间的关系，表明了兰科植物在整个被子植物演化中的历史。

Introduction

拟兰亚科是兰科中较小的一个分支，仅含拟兰属和三蕊兰属两个属，仅分布于东南亚、日本和澳大利亚北部的湿润地区。尽管拟兰亚科与其余兰科植物存在一些共同的衍征，比如含胚乳较少的小的种子和真菌异养型圆球茎，拟兰亚科的植物存在其独特的性状，其中最为突出的就是它们花的形态。深圳拟兰的花不倒置，类似于茄属植物，生殖融合前后花药都紧紧环绕着柱头，子房较长，花被片辐射对称，唇瓣无特化。三辦雄蕊融合形成一个简单的合蕊柱，其中两辦是可育的，花药里为散生粒状花粉，花粉颗粒并不聚合在一起形成花粉块。深圳拟兰的这些特性与其它兰科亚科植物有所区别，其它兰科亚科植物一般表现为三个萼片、三个花瓣，其中一瓣特化为唇瓣，雄雌蕊融合形成更加复杂的合蕊柱。深圳拟兰的这些特性虽然与其它兰科亚科植物有所差别，但与天门冬目下兰科的姊妹科仙茅科的一些物种性状类似。

Results

作者结合不同的方法对深圳拟兰进行的全基因组测序工作，最后组装大小为346Mb。作者共注释了21841个蛋白编码基因，其中92.5%的基因有转录组数据的验证。利用BUSCO数据库对深圳拟兰的基因组进行评估，发现深圳拟兰占93.62%的核心植物基因集，显示基因组组装质量较高。为了能够顺利进行比较基因组学的分析，作者还利用三代测序对已经报道的蝴蝶兰基因组和铁皮石斛基因组进行了优化、提升。

作者基于15个物种429个单拷贝基因家族的序列构建了高可信的进化树，并估计了这15个物种间的分化时间（Fig. 1）。作者利用CAFE计算了基因家族大小以研究兰科植物及其近缘物种在进化中的基因家族扩张与收缩（Fig. 1）。通过对12个物种的比对，作者鉴定了兰科植物474个特有的基因家族。GO和KEGG富集分析发现这些基因主要与“O-甲基转移酶活性”、“半胱氨酸型肽酶活性”、“黄酮和黄酮醇的生物合成”以及“芪类，二芳基庚酸类和姜辣素生物合成”等条目相关。

深圳拟兰旁系同源基因的同义位点同义替换率(KS)分布显示在KS ≈ 1时存在一个明显的峰值。其余四个兰花亚科的植物在KS值0.7~1.1之间均存在一个类似的峰值。这些峰值可能暗示在不同兰花亚科存在多个独立的基因组复制（WGD）事件，或者更加简单的来说，这些兰科植物共享了一次全基因组复制事件。通过比较兰科不同物种旁系同源与直系同源基因的KS值分布，以及比较兰花与天门冬目下兰科姊妹科天门冬科芦笋属芦笋的结果显示前面在兰花检测到的基因组复制事件在天门冬目其余物种中是不存在的（Fig. 2a）。通过时间估计发现WGD发生的时间与现存所有兰科植物共同祖先的早期分化时间较为接近，表明检测到的这次WGD很有可能是所有兰科植物最近的共同祖先发生的一次WGD事件。

深圳拟兰基因组内共线性分析鉴定到了两次WGD（Fig. 2b）。通过深圳拟兰与无油樟及葡萄的基因组共线性分析，同样支持深圳拟兰至少发生过两次WGD事件，比如，深圳拟兰基因组四个旁系同源的片段对应无油樟基因组上一处直系同源区域（Fig. 2c）。通过比较深圳拟兰与菠萝及芦笋的基因组显示了4:4的共线性模式，与在菠萝中提出的发生过两次单子叶WGD事件相一致，显示这三个物种在发生WGD的次数这一点上情况类似。综上，这些共线性模式表明这两次WGD中更加古老的一次是深圳拟兰与菠萝及芦笋所共享的，同时也是为大多单子叶植物所共享的，即τ WGD事件；另外同样也证实了这两次WGD中较近期那次是兰科植物这一系独立发生的。作者通过分析所有三个兰科植物（深圳拟兰、蝴蝶兰及铁皮石斛）共线性块上旁系同源基因的基因树将较为近期的那次WGD定位在了兰科植物的进化枝上，同时也为较为古老的那次WGD（即单子叶τ WGD）提供了证据（Fig. 3）。

深圳拟兰存在一些兰科植物类似的特征，包括含未特化唇瓣的辐射对称花被，雌雄蕊部分融合的合蕊柱，并不聚合形成花粉块的花粉，以及适应陆地生长的地下根。深圳拟兰基因组包含36个推定的具有功能的MADS-box基因，其中27个是第二类的MADS-box基因。深圳拟兰中有两个第二类MADS-box家族的亚家族明显基因数量减少，其中B-AP3含2个基因，E含3个基因，而蝴蝶兰中含4个B-AP3类基因和6个E类基因，铁皮石斛中含4个B-AP3类基因和5个E类基因（Fig. 4a）。先前的研究证明B-AP3类和E类MADS-box基因亚家族在花器官中具不同表达模式的基因的扩张可能与兰科特有的唇瓣和合蕊柱相关，另外重复的B-AP3类基因对兰科植物花被的模式有重要作用。作者在兰科5个亚科的转录组中鉴定了B-AP3类基因，并坚定了仙茅科大仙茅花转录组的B类MADS-box基因，大仙茅具有深圳拟兰类似的花瓣状花被片和粉状花粉的特征。结果发现，在B-AP3类的两个亚枝里面，深圳拟兰和大仙茅都各自只有一个基因，而其他兰科植物都有1~2个基因。所有的这些B-AP3类基因在花芽里面都是高表达的。通过深圳拟兰与大仙茅的相似性表明较少的MADS-boxB-AP3类基因可能代表着深圳拟兰处于一个较为原始的状态，同时对于未特化唇瓣和部分融合的合蕊柱有着重要作用。B-AP3类和E类MADS-box基因可能在非深圳拟兰的其它兰科植物中独立扩增了，亦或是在兰科共同的祖先中由于WGD共同扩增了，然后在深圳拟兰中丢失了旁系同源基因，导致了其返祖性状。B-AP3类基因树的拓扑结构以及兰科植物B-AP3类基因的共线性分析比较支持后面一种假说。作者推测不同B-AP3类和E类MADS-box基因旁系同源基因的保留及随后的基因新功能及亚功能化最终导致了其它兰科植物中的唇瓣表型（Fig. 4b）。

将花粉粒整合形成一个紧凑的单位（即，花粉块）便于传粉媒介授粉是兰科植物进化历史上的一个关键新性状，且可能对兰科植物的全球辐射起到重要作用。在种子植物中，MIKC*类基因的亚枝P和S是雄配子体发育的主要调控子。P亚枝除了在深圳拟兰中存在，在其余的所有兰科植物中都缺失掉。基因表达分析显示在兰花和大仙茅中，MIKC*类基因主要在花粉块或花粉中表达，显示了其在花粉发育中起作用。尽管绝大多数的兰科植物花粉聚在一起会形成花粉块，但深圳拟兰的花粉散状分布，与大仙茅、水稻、拟南芥的花粉类似。因此，作者推测MIKC*类基因P亚枝的丢失可能与花粉块的进化相关（Fig. 4a, c）。

兰科植物种子体积和内含物的减少导致其种子变得非常的小，这是兰科植物进化中一个比较重要的方面，在所有的兰科植物中，胚乳是缺失的。前人研究显示第一类的MADS-box基因对于胚乳的发育起始是至关重要的，并且在深圳拟兰、蝴蝶兰及大仙茅的种子中发现了第一类Mα和Mγ的MADS-box基因。有趣的是，三个已测序的兰科植物基因组中都不含有第一类Mβ的MADS-box基因（Fig. 4a），而在拟南芥、杨树、水稻及大仙茅中都存在。因此，兰科植物中胚乳的却是可能跟第一类Mβ的MADS-box基因的丢失相关（Fig. 4d）。

兰花是开花植物中少有的能够附生或石生，依附于林木或者岩石，通过景天酸代谢途径在干旱的环境中生长。附生兰花的根高度特化，比如蝴蝶兰和铁皮石斛，而不同于陆生兰花的根，比如深圳拟兰。这些气生根会发育出一种海绵状表皮的根膜，能够在降雨时捕获富含营养的流水，这体现了附生兰花的适应性进化。拟南芥的AGL12基因参与根细胞的分化。深圳拟兰中含有一个AGL12分枝，这与拟南芥和水稻中的情况一致。另外，作者也在大仙茅中鉴定到了类似AGL12的基因。在深圳拟兰和大仙茅中，AGL12基因均在根组织中高表达。有趣的是，作者并未在附生兰花中鉴定到AGL12基因，这表明该类基因的缺失可能与附生兰花不能发育出陆生的真根相关（Fig. 4e）。唇形目下的丝叶狸藻没有真根，同样也缺失了AGL12这一枝或者类似的基因。拟南芥的ANR1基因是响应外部环境营养供给调控侧根发育的关键基因。作者鉴定了2个蝴蝶兰和3个铁皮石斛ANR1基因亚家族的成员，相对于深圳拟兰中4个ANR1基因亚家族基因较少，这与附生兰花中并无侧根发育的情况相一致。

Conclusion

总的来说，深圳拟兰的基因组为研究兰科植物的进化提供了一个参考，作者鉴定了一次兰科所有植物共享的一次WGD事件，促进了兰花祖先基因的重建，并为兰花唇瓣、合蕊柱、花粉块和无胚乳种子发育等特有性状以及附生兰花进化提供了新的见解。

通讯：刘仲健 (http://people.ucas.ac.cn/~0028655)

个人简介：1978-09~1982-06，华南农业大学，学士；1999-11~2006-08，深圳市园林集团公司，总经理、法人代表、党委负责人；2006-09~现在，全国兰科植物种质资源保护中心；深圳市兰科植物保护研究中心，法人代表、主任、首席科学家。

doi: doi:10.1038/nature23897

（P.S. 附ppt一份：链接: https://pan.baidu.com/s/1kUQ8VeZ 密码: 7qah）