一、“检测了”不等于“测准了”

宿主细胞残留DNA（HCD）是生物制品质量控制中绕不开的一项指标。世界卫生组织与美国FDA对终产品中宿主细胞DNA的限制是每剂不超过10 ng、片段长度200 bp以下，中国药典通则3407（外源性DNA残留量测定法）也规定了相应的测定方法。但实际工作中，不少人遇到过这样的情况：同一批样品送到两家实验室，报出的残留DNA数值相差两三倍；甚至同一家实验室换一批试剂重测，结果也对不上。问题往往不在仪器，而在样品的“基质”。

二、基质会从两个环节“偷走”你的DNA

CHO细胞表达的单抗、融合蛋白或疫苗，本身是一个成分复杂的体系：毫克级每毫升高浓度的抗体、缓冲盐、蔗糖或山梨醇、聚山梨酯类表面活性剂，部分产品还含有阳离子多肽类成分。这些成分会从两个环节影响残留DNA的测定。

一是提取环节。残留DNA在样品中常与蛋白形成复合物，或被包裹在脂质结构中，难以被吸附柱或磁珠有效捕获；洗脱体积不足、洗脱不完全，DNA就留在了柱子上。二是扩增环节。共提取进来的蛋白、多糖、脂类和去污剂会抑制Taq酶活性，表现为Ct值后移，换算出的浓度自然偏低。这时看到的“干净”，其实是被“压”下去的结果。

要同时暴露这两个环节，最实用的办法是做加标回收（spike recovery）：向样品中加入已知量的宿主DNA参考品，与未加标样品平行处理、平行检测，按下式计算回收率——（加标样品测得量－未加标样品测得量）÷加标量×100%。只有回收率落在可接受区间，未加标样品的那个数值才值得相信。

三、基质效应能有多大

2023年，德国RHEACELL公司与哈佛医学院团队在Cells上发表了一项按药品监管要求完成的qPCR方法验证。他们建立的TaqMan qPCR方法用于定量移植到免疫缺陷小鼠体内的人间充质干细胞在14种组织与血液中的分布，并系统开展了加标回收实验。结果显示，不同组织的加标回收率跨度极大，从11%到174%；其中血液最低，只有11%的加标细胞被检出。作者指出，监管指南与最佳实践通常认为回收率落在30%~100%属于可接受范围，而他们测试的14种组织里，有2种低于30%、3种高于100%。论文明确写道，忽略基质效应会显著低估样品中真实的细胞数量，并据此提出以“基质因子”（回收率的倒数）对结果进行校正。研究对象虽是细胞治疗产品的生物分布，但道理完全互通：同样一份DNA，换一个基质，测出的数字可以差一个数量级。

美国FDA的研究者提供了一个更贴近生物制品的案例。鱼精蛋白硫酸盐是鲑鱼来源、分子量约4 kDa的阳离子多肽，因带正电，与带负电的DNA之间强烈的静电作用使残留DNA的分离和测定格外困难。Sommers等在Data Brief上报告：把单次100 μL洗脱改为两次100 μL洗脱后，加标回收率从平均42.8%（范围27%~70%）提高到90.9%（范围72%~105%），标准曲线的R²也从0.971提升到0.999；方法验收标准据此定为回收率70%~130%、CV不超过25%。同时，在0.002 pg/μL的极低浓度下，CV高达39.1%、回收率达130.6%，说明低浓度区间的精度会明显变差。换句话说，仅仅改一个洗脱体积，同一份样品的测定值就能翻一倍。

美国默克的分析团队在The AAPS Journal上进一步说明，复杂样品中的干扰物不只是“稀释了信号”。他们用荧光染料法测定疫苗原液中的宿主细胞DNA时发现，样品中的RNA、蛋白和去污剂会与DNA竞争染料结合，而宿主DNA与蛋白形成的聚集体会产生“屏蔽效应”，使染料无法接触到DNA，测出的值系统性偏低；只有先做酶解前处理（RNase A降解RNA、蛋白酶K消化蛋白），并加入去氧胆酸盐破坏基质中的相互作用，加标回收率才回到可接受范围。该文同时指出，qPCR由于引物探针的高特异性，受非特异干扰的程度相对最小，但在复杂基质中往往仍需配合DNA提取步骤。

四、三条选型原则

第一，报告里必须带回收率。一个没有加标回收数据的残留DNA结果，只是一个“相对读数”，无法判断它是真实值，还是被基质压低后的残值。可接受的回收率区间因方法而异，FDA在上述案例中采用70%~130%，也有不少方法放宽至50%~150%，无论采用哪一个，都应该在报告中明确体现。

第二，不要忽视前处理细节。洗脱体积从100 μL到200 μL这样一个看似微小的改动，就能让回收率从42.8%提升到90.9%。不同基质需要不同的提取策略，方法在一种样品形态上验证通过，不等于在所有产品形态上都适用。

第三，选择以探针法qPCR为原理、并内置质量控制体系的试剂盒。中国食品药品检定研究院与湖州申科合作开发的Vero细胞残留DNA qPCR方法给出了一个参照：加标回收率87.7%~98.5%、中间精密度RSD小于25%，并且在6种不同品牌的荧光定量PCR仪上定量限保持一致，说明经过规范验证的探针法qPCR能够做到“换仪器结果不漂移”。对使用者而言，一个成熟试剂盒的标志，是它自带内参以监控PCR是否受到抑制、自带加标回收质控以评价提取效率，而不是只提供一条标准曲线。

翼和生物CHO细胞DNA残留检测试剂盒，采用TaqMan探针法荧光定量PCR，针对CHO宿主细胞基因组重复序列设计引物与探针，检测限低至1 fg/μL；配套CHO DNA定量参考品已溯源至国家标准品；标准曲线定量参考品预分装冻干，3小时内出结果，适配主流荧光定量PCR仪。

参考文献：

1. Schröder HM, Niebergall-Roth E, Norrick A, Esterlechner J, Ganss C, Frank MH, Kluth MA. Drug Regulatory-Compliant Validation of a qPCR Assay for Bioanalysis Studies of a Cell Therapy Product with a Special Focus on Matrix Interferences in a Wide Range of Organ Tissues. Cells. 2023 Jul 5;12(13):1788. doi: 10.3390/cells12131788.

2. Sommers C, Rosenzweig B, Oum L, Thompson K, Keire DA. Development of methods for data quantitation of spiked salmon host cell DNA in protamine sulfate by qPCR. Data Brief. 2018 Oct 4;21:644-652. doi: 10.1016/j.dib.2018.09.135.

3. Lauro ML, Bowman AM, Smith JP, Gaye SN, Acevedo-Skrip J, DePhillips PA, Loughney JW. Overcoming Biopharmaceutical Interferents for Quantitation of Host Cell DNA Using an Automated, High-Throughput Methodology. AAPS J. 2022 Dec 8;25(1):10. doi: 10.1208/s12248-022-00764-4.

4. Zhao D, Zong W, Wu W, Li Y, Wu Z, Yang Z, Cao S. Development and validation of a qPCR assay for the detection of residual host cell DNA in rabies vaccines produced in Vero cells. Front Bioeng Biotechnol. 2025 Oct 6;13:1611428. doi: 10.3389/fbioe.2025.1611428.

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