一、一个反复出现的困惑：细胞没事，数据不对

细胞形态正常，增殖曲线漂亮，培养基清亮，可实验就是重复不出来。碰到这种情况，多数人先怀疑操作、试剂、仪器，很少想到细胞本身已经被污染了。

2021年，纽约大学Grossman医学院的Doyle团队做了一件很直接的事：他们对同一株人声带成纤维细胞做RNA测序，比较支原体阳性与阴性细胞的基因表达。在分析的25 074个基因中，有近19%（4732个）在两组间差异表达；加入地塞米松处理后，两组之间仍有3580个基因（14.3%）表达不同。也就是说，污染不只改变了细胞的基线表达，还改变了细胞对外源刺激的响应方式。

对做组学和功能实验的人来说，这意味着一个很现实的后果：你算出来的差异表达基因里，可能有相当一部分并不来自你的实验处理，而来自培养瓶里那点看不见的污染。

二、为什么常规观察发现不了

支原体没有细胞壁，体积只有普通细菌的几分之一，不使培养基变浑浊，也不像多数细菌那样在镜下留下明显痕迹。它们能黏附在细胞表面，甚至进入细胞内部，与宿主细胞长期共存。靠肉眼观察和常规换液，很难发现它们。

Drexler和Uphoff在2002年关于细胞培养支原体污染的综述中已经指出，这类污染至今仍是细胞培养中的主要问题，能在被感染的培养体系中引起几乎无限多样的影响，并且对培养中最常用的抗生素普遍耐药。

三、被改写的远不止基因表达

蛋白层面。2018年，Hoff等在《Cytotechnology》上用反相蛋白阵列检测了235个蛋白：感染支原体的白血病细胞与从未感染的细胞相比，18.7%的蛋白发生了显著改变；这些改变的蛋白显著富集于凋亡信号与自磷酸化相关过程，提示细胞处于更高的应激状态、生长速率下降。作者在结论中直接写道，支原体感染改变了细胞的蛋白表达水平，从而潜在地干扰实验结果。

代谢层面。2016年，Yu等在《Analytical and Bioanalytical Chemistry》上用液相色谱—质谱对PANC-1细胞做代谢组分析，鉴定出23种显著变化的代谢物，集中在精氨酸代谢、嘌呤代谢和能量供应。其中L-精氨酸下降约12倍——这与支原体把精氨酸当作主要能源的特性一致。作者因此强调：凡是做代谢组学研究，常规检查细胞培养的支原体污染是必要环节，而不是可选项。

四、污染还可以“隔空”影响细胞

即使支原体没有直接贴附到细胞上，它的胞外囊泡也能替它完成这件事。2021年，Mouzykantov等在《Acta Naturae》上报告：细胞培养与疫苗制品中最常见的污染种之一Acholeplasma laidlawii所释放的囊泡，可以进入人皮肤成纤维细胞，孵育4小时后即可检测到细胞蛋白表达的改变。对正在做外泌体/细胞外囊泡研究的实验室来说，这还有另一层提示：囊泡制剂本身的洁净度，也需要纳入质控范围。

结论与选型

支原体污染最麻烦的地方，不是让细胞死掉，而是让细胞“看起来没事”，却已经改写了基因表达谱、蛋白谱和代谢谱。等到形态学出现异常再处理，前面几个月的数据可能已经不可用了。

因此，用于常规筛查的检测方案至少要满足三条：一是覆盖足够广，能覆盖细胞培养中的高频污染种；二是灵敏度足够高，能在细胞还“正常”的时候就发出警报；三是阴性结果可信，需要内部质控（IPC）来排除PCR抑制造成的假阴性。

更重要的是把它变成制度：新引入的细胞系入库必检，之后纳入固定的筛查周期，并与STR鉴定、种属鉴定一起，构成细胞的完整质量档案。

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参考文献：

1. Doyle C, Nakamura R, Bing R, Rousseau B, Branski RC. Mycoplasma affects baseline gene expression and the response to glucocorticoids in vocal fold fibroblasts. J Med Microbiol. 2021 May;70(5):001362. doi: 10.1099/jmm.0.001362.

2. Hoff FW, Hu CW, Qutub AA, Qiu Y, Graver E, Hoang G, Chauhan M, de Bont ESJM, Kornblau SM. Mycoplasma contamination of leukemic cell lines alters protein expression determined by reverse phase protein arrays. Cytotechnology. 2018 Dec;70(6):1529-1535. doi: 10.1007/s10616-018-0244-2.

3. Yu T, Wang Y, Zhang H, Johnson CH, Jiang Y, Li X, Wu Z, Liu T, Krausz KW, Yu A, Gonzalez FJ, Huang M, Bi H. Metabolomics reveals mycoplasma contamination interferes with the metabolism of PANC-1 cells. Anal Bioanal Chem. 2016 Jun;408(16):4267-73. doi: 10.1007/s00216-016-9525-9.

4. Mouzykantov AA, Rozhina EV, Fakhrullin RF, Gomzikova MO, Zolotykh MA, Chernova OA, Chernov VM. Extracellular Vesicles from Mycoplasmas Can Penetrate Eukaryotic Cells In Vitro and Modulate the Cellular Proteome. Acta Naturae. 2021 Oct-Dec;13(4):82-88. doi: 10.32607/actanaturae.11506.

5. Drexler HG, Uphoff CC. Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention. Cytotechnology. 2002 Jul;39(2):75-90. doi: 10.1023/A:1022913015916.

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