原发性免疫缺陷病（PID）是一类主要由单基因突变导致的罕见遗传性疾病。随着二代测序（NGS）和Sanger测序的普及，大部分致病性单核苷酸变异（SNV）和小片段插入缺失（indel）得以被识别。然而，由大片段插入或缺失导致的拷贝数变异（CNV） 却常常成为漏网之鱼——Sanger测序对CNV的检出能力有限，可能将杂合性大片段缺失误判为野生型。

当常规测序“看不到”CNV时，怎么办？

发表在 Clinical and Experimental Immunology 上的一项研究给出了答案：微滴式数字PCR（ddPCR） 是一种可用于CNV验证的高效、经济的方法。研究团队采用Bio-Rad QX200 ddPCR系统，成功在3类PID患者中验证了 NFKB1、SERPING1 和 SH2D1A 基因的大片段缺失。

ddPCR凭什么脱颖而出？

绝对定量，无需标准曲线：ddPCR将反应体系分割成数万个微滴，通过计数阳性微滴直接得出靶分子的绝对拷贝数。与传统qPCR依赖标准曲线不同，ddPCR不依赖Ct值，结果更精准、重复性更好。

精准分辨微小拷贝数差异：ddPCR能够有效区分浓度差异微小的样品（如1.1倍差异），甚至可分辨1倍以内的拷贝数差异。这对于区分杂合缺失（1拷贝）与正常（2拷贝）至关重要。

成本可控，灵活适配：研究指出，对于人口较少国家或罕见病检测场景，ddPCR的EvaGreen染料法比探针法和MLPA更具成本效益。对于小基因（10-12个外显子以内）或家系隔离分析，ddPCR尤为适用。

三个真实案例，见证ddPCR的实力

案例一：NFKB1基因缺失（CVID样疾病）一位61岁女性患者（Patient 1）因泛低丙种球蛋白血症、特发性血小板减少等表现被诊断为疑似CVID。NGS基因panel检测提示 NFKB1 外显子2和3杂合缺失。研究团队采用EvaGreen染料法ddPCR，以AP3B1和RPP30为双参考基因，确认该患者两外显子拷贝数分别为0.88和0.92（正常为2），而其女儿（Patient 2）拷贝数正常（1.94和1.96），排除了携带风险。

案例二：SERPING1基因外显子4缺失（遗传性血管性水肿，HAE）一位5岁男性患儿（Patient 3），其母亲和祖母均为1型HAE（C1抑制剂缺乏症）患者。Sanger测序未检出 SERPING1 基因致病性变异。但采用探针法ddPCR检测发现，该患儿 SERPING1 外显子4为单拷贝（杂合缺失），其余7个外显子均为双拷贝。该结果随后经MLPA外部验证一致。

案例三：SH2D1A基因外显子1缺失（X连锁淋巴增生综合征，XLP）一名疑似XLP的男性患者（Patient 4），常规PCR无法扩增 SH2D1A 外显子1。MLPA和ddPCR双双证实其为 外显子1半合子缺失（男性仅1条X染色体），该缺失将导致翻译起始密码子丢失、蛋白功能丧失。

ddPCR vs. MLPA：互补而非替代

MLPA长期以来是CNV检测的金标准。但ddPCR在某些场景下展现出独特优势：ddPCR对低比例嵌合体CNV的检测可能比MLPA更灵敏；在定量精度方面，部分研究显示dPCR在SMN1/SMN2拷贝数定量上优于MLPA；且ddPCR耗时更短、成本更低。两种技术可互为补充。

[1]Woon ST, Mayes J, Quach A, et al. Droplet digital PCR for identifying copy number variations in patients with primary immunodeficiency disorders. Clin Exp Immunol. 2022;207(3):329-335.

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