传统的Sanger测序是突变验证的“金标准”。但当验证规模从几个样本扩大到数百甚至上千时，这一金标准显露出明显的局限性。

Sanger测序成本与样本量成正比增加且通量严重受限，阻碍项目的进行。

这就是大规模突变验证面临的核心困境：如何在控制成本和时间的前提下，保证验证结果的准确性和可靠性？

PCR-LDR包含聚合酶链式反应和连接酶检测反应，是一种两级级联放大技术：首先通过PCR扩增包含目标位点的DNA片段，然后加入紧邻突变位点的特异性探针进行LDR反应。只有完全匹配时，连接酶才会将探针连接起来，通过荧光信号检测连接产物。

其技术优势主要体现在以下四个方面：

超高特异性——连接酶的双重识别机制，两条探针必须与靶序列完全匹配才能在连接酶作用下连接。

卓越灵敏度——表现在其具有极低的检测限。

多重检测能力——允许单次反应同时验证多个突变位点。通过设计不同荧光标记的探针，可以在一个反应管中同时检测多达数十个位点，显著提高了验证效率。

经济高效性——当样本量超过一定阈值时，PCR-LDR的单位样本验证成本远低于Sanger测序。

多重PCR扩增子捕获结合二代测序则代表了一种完全不同的技术。作为高度集成的系统，多重PCR+NGS平台一次运行可验证数百个样本的数十个位点。

在通量灵活性方面，该技术可根据需要灵活调整验证规模。无论是验证少量样本的多个位点，还是验证多个样本的少量位点，都可以在同一技术框架下高效完成，只需调整多重PCR的引物组合和测序深度。

成本结构的规模效应尤为明显。随着验证样本量和位点数的增加，单位数据点的成本显著下降。当同时验证多个位点时，边际成本增加很小，特别适合需要验证多个候选突变的大规模研究。

基于以上对比，选择决策可以遵循以下路径：

当验证目标少于20个明确位点、样本量超过数十个且对检测灵敏度要求极高时，PCR-LDR是最优选择。

当需要验证20个以上位点或样本量大且希望一次性获得全面数据时，多重PCR+NGS具有明显优势。

对于少量样本、位点数不超过3个的小规模验证，传统Sanger测序仍具实用价值。

随着精准医学研究的不断深入，阳性突变的大规模验证已成为转化研究的关键环节。两种高效验证技术可以解决大规模验证中的瓶颈，上海翼和可以为有需求的客户提供相应的服务。