一直在博客里面强调应用性研究（iCubate技术平台的开发和多重PCR做感染性疾病的分子鉴别诊断），在科学网博客里的第一篇文章就是讲应用性研究的重要性。其实，我们也做基础研究。上星期五刚刚得到消息，我们第一篇有关免疫组库的论文被PNAS接受了(High throughput sequencing reveals a complex pattern of dynamic interrelationships among human T cell subsets)，很快就会发表。这里先简要给大家介绍一下这方面的工作。

方法：
取人外周血，用磁珠做免疫细胞的分类（比如Th1, Th2, Treg, Tc, Tn, Ta, Tm等），分类好的细胞提取mRNA, 用我们独特的arm-PCR多重PCR技术扩增所有标本内的表达的重组VDJ，然后用新一代测序技术（罗氏454）进行测序，最后做结果分析。



结果:
一般一次实验能得到三十多万个有效读数(read)，一个有效读数就是得到了完整的VDJ分子序列。一个实验能得到十七万五千多独特的CDR3（每个CDR3代表一个独特的T细胞受体或抗体的一条链）。平均每个读到的分子得到250个碱基长的序列。所以，每个实验可以得到大概 五十万到一百万个碱基的序列。而且这些免疫大分子的序列都是从一个人身上得到的，来源于10毫升外周血。



到目前为止，我们得到的数据是GenBank里面过去二十年累积存如的免疫大分子序列的一百多倍。有关结果待我们陆续发表。我们做了肿瘤（乳癌，结肠癌，肺癌，血液病等），系统性红斑狼疮等病人的免疫组库研究。还做了疫苗产生的免疫组库演变的研究。

数据表达方式：斯坦福大学基因组技术中心的王春林博士是论文的第一作者，他是高通量测序数据分析（尤其是454平台）的全世界少有的几个专家，为免疫组库项目得到的数据分析写了很多独特的软件，下面的二维和三维表达图。二维图中每个点代表一个VDJ, 三维图也是如此。这样一个标本内免疫组库的表达情形就一目了然了。




讨论：
这篇文章所介绍的技术代表免疫学方面的一个重大技术突破。它依赖过去二十年免疫学技术（单克隆抗体，流式细胞仪，用表面抗体进行细胞分类等）的最新进展；也依赖过去二十年分子生物学技术（PCR, 多重PCR, 高通量测序）的最新进展；它更有赖于过去二十年信息技术的飞速发展（电脑硬件，软件，计算能力，信息储存能力等）。

从群体的角度讲，人类的免疫大分子的多样性是十分可观的（可能有10的25次方那么多！）。因为人类几乎能对所有外来感染源产生免疫反应。可是在个体水平，我们 的免疫组库的大小就有限了。个体免疫组库的内容受三个因素的控制：遗传因素（HLA分型）；抗原（包括病原体）接触史；和时时刻刻的免疫调控。



个体化的免疫组库研究很快就可以用来做疾病相关性研究，寻找Bio-marker，对疾病机理进行一个全新角度的探讨。以前认为和遗传密切相关的很多“多 基因病”很可能就是免疫系统的疾病，可以通过研究免疫组库得到一些答案或线索。这些结果可以促进对更多疾病的早期诊断，治疗甚至预防。

通过跟踪疫苗免疫后免疫组库的变化，可以开发出更有效，更安全的疫苗。

免疫组库技术无疑也会成为新药开发的一个热门技术。




我们从07年开始做这方面的工作，有关专利也是两年前就递送进去了。我在新浪博客上也陆陆续续“透露”了不少有关的动向和有关免疫组库方面的学习和思考。不过用高通量测序方法研究免疫组库，我们并不是第一个发表论文的。今年在《科学》杂志发表了一篇用高通量测序技术研究鱼的免疫组库的文章，《血液》杂志两个月前也有发表用Solexa测基因组免疫组库的。几种方法的优缺点过段时间我再详细分析。感兴趣的大家也可以自己去把论文找来看。

我觉得我们方法的优势是信号扩增技术和使用454平台。一种方法如果要想得到更广泛的应用，需要使用简单，临床标本容易得到。技术的敏感性，包容性， 和定量能力是衡量免疫组库研究技术的硬性指标：10毫升血里面可能有五百万B细胞，两千万T细胞，考虑到免疫细胞的多样性，这10毫升血里面可能每个特定 的淋巴细胞仅有几个。所以扩增的方法需要敏感性极强（包容性好，最大限度地覆盖不同的免疫细胞），而且扩增过程和测序过程不破坏细胞间的比例（半定量）： 不是高表达的得到更多的扩增，而数目较少的克隆细胞就被掩盖了。arm-PCR技术是成功的关键，我们能从一个标本里面扩增出17万个独特的分子，说明 arm-PCR技术的敏感性和覆盖性都非常好。

新一代高通量测序技术现在市场上站主导地位的有三个： 454, SOLiD, Illumina. 我们选择较贵的454平台是因为免疫大分子是重复性高，多态性（hypermutation, n-addition)极高，而且每个分子都可能是从新测序（de novo sequencing), 所以用读短分子的Illumina或SOLiD等平台就比较不适合。下一步，我们在继续进行基础研究的同时，也在尽快把方法转变成一个使用方便的工具，让更多的人能参与到免疫组库的相关研究中去。现在，这还是非常昂贵的实 验，一次454测序光试剂费用就可能上万美金。我们已经“烧”掉近一百万美金了（其它数据会陆续披露的）。

传统的免疫学是以抗原为中心的，试图从抗原找到抗体（或T细胞受体），有了免疫组库技术，Reverse Immunology 就成为可能：从大量的抗体（T cell receptors)信息出发，去寻找相应的抗原。

近代免疫学的主要技术是流式细胞仪。它可以让我们把免疫细胞细分，不同的发育阶段，不同的功能团体，都可以分离出来。但是再细分下去，分到单个细胞水平就 难了。arm-PCR加高通量测序给我们提供了进一步细分下去的能力，让免疫学家，生物学家看到以前所看不到的，看不全的。

免疫组库技术也可以看成是基因组技术的分支。但是它不是象GWAS那样扫描整个基因组来寻找遗传多态性和疾病之间的关系；免疫组库技术的研究重点就是免疫大分子（T 细胞受体，抗体，和HLA)，就集中在基因组中的几个小点上。但是这几个位点却是人类基因组中最“活跃”的，决定着人如何与环境相互作用。传统基因组遗传学是在寻找疾病的”内因“；而免疫组库则是研究内因和外因的相互作用界面。

和基因组学，蛋白组学等一样，既然称为”组库“学，意思就是有高通量技术，有大量的数据。而且在方法学上也是：先有数据，再有假说 （传统生物学研究都是先有假说，再去设计实验，然后再证明假说）。

创新型科研和创新性技术（产品）类似，都是把现阶段最佳的技术和方法加以巧妙的整合，然后去解决一个前人没有解决的问题。把我们独特的arm-PCR技术 （论文中有详细介绍arm-PCR的原理）和新一代高通量测序相结合就拓宽了传统免疫学的视野；我们把arm-PCR和新的iCubate技术平台结合也 就给临床分子鉴别诊断增加了新的工具。

创业：
创业是加速创新技术和产品推广的最有效的方法。所以我们又成立了两个公司，iCubate 和 iRepertoire. 为什么成立两个公司而不是一个？因为一个是以做产品为主（iCubate)而另一个是以做技术为主（iR),商业模式不同。iCubate的研发工作已经取得了很好的成果；iRepertoire也已经取得了大量有意义的数据，但是产业化的步伐则刚刚开始。





历史常有巧合，二十年前我还在读博士的时候也是在PNAS上发表了一篇论文，介绍开发的一个新的给基因定位的技术（见二十年前的创新一文）。也是因为那篇论文，让我认识了我的生物技术创业导师Jim Hudson. 二十年后，我在他创办的研究院（HudsonAlpha 里面的Hudson就是Jim)从新开始新的一轮创新和创业。

另外，我还要强调团队的重要，我们实验室的Catherine Sanders (博士后）是读免疫专业的，更有丰富的免疫学实验基础；Qunying Yang则是从Genaco就跟我合作的做多重PCR实验的专家；Harry 是UAB免疫系主任，钻研免疫组库二十年；斯坦福那边的Elijiah，Baback等是美国使用454最早的一批科学家；前面提到的王春林博士不但是生物信息方面的专家，还是微生物和免疫出身的，论文的主笔是春林。整个团队缺一不可，配合得非常完美。

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