生物技术创新创业分享 http://blog.sciencenet.cn/u/SNPs 美国HudsonAlpha研究院的研究员。做分子鉴别诊断平台技术的开发和免疫组库基础科研。

博文

参与开创新学科:免疫组库(immune repertoireomics) 精选

已有 32046 次阅读 2009-12-14 00:30 |个人分类:免疫组库新领域|系统分类:论文交流| 生物技术, 创新, 创业

一直在博客里面强调应用性研究(iCubate技术平台的开发和多重PCR做感染性疾病的分子鉴别诊断),在科学网博客里的第一篇文章就是讲应用性研究的重要性。其实,我们也做基础研究。上星期五刚刚得到消息,我们第一篇有关免疫组库的论文被PNAS接受了(High throughput sequencing reveals a complex pattern of dynamic interrelationships among human T cell subsets),很快就会发表。这里先简要给大家介绍一下这方面的工作。

方法:
取人外周血,用磁珠做免疫细胞的分类(比如Th1, Th2, Treg, Tc, Tn, Ta, Tm等),分类好的细胞提取mRNA, 用我们独特的arm-PCR多重PCR技术扩增所有标本内的表达的重组VDJ,然后用新一代测序技术(罗氏454)进行测序,最后做结果分析。



结果:
一般一次实验能得到三十多万个有效读数(read),一个有效读数就是得到了完整的VDJ分子序列。一个实验能得到十七万五千多独特的CDR3(每个CDR3代表一个独特的T细胞受体或抗体的一条链)。平均每个读到的分子得到250个碱基长的序列。所以,每个实验可以得到大概 五十万到一百万个碱基的序列。而且这些免疫大分子的序列都是从一个人身上得到的,来源于10毫升外周血。



到目前为止,我们得到的数据是GenBank里面过去二十年累积存如的免疫大分子序列的一百多倍。有关结果待我们陆续发表。我们做了肿瘤(乳癌,结肠癌,肺癌,血液病等),系统性红斑狼疮等病人的免疫组库研究。还做了疫苗产生的免疫组库演变的研究。

数据表达方式:斯坦福大学基因组技术中心的王春林博士是论文的第一作者,他是高通量测序数据分析(尤其是454平台)的全世界少有的几个专家,为免疫组库项目得到的数据分析写了很多独特的软件,下面的二维和三维表达图。二维图中每个点代表一个VDJ, 三维图也是如此。这样一个标本内免疫组库的表达情形就一目了然了。




讨论:
这篇文章所介绍的技术代表免疫学方面的一个重大技术突破。它依赖过去二十年免疫学技术(单克隆抗体,流式细胞仪,用表面抗体进行细胞分类等)的最新进展;也依赖过去二十年分子生物学技术(PCR, 多重PCR, 高通量测序)的最新进展;它更有赖于过去二十年信息技术的飞速发展(电脑硬件,软件,计算能力,信息储存能力等)。

从群体的角度讲,人类的免疫大分子的多样性是十分可观的(可能有10的25次方那么多!)。因为人类几乎能对所有外来感染源产生免疫反应。可是在个体水平,我们 的免疫组库的大小就有限了。个体免疫组库的内容受三个因素的控制:遗传因素(HLA分型);抗原(包括病原体)接触史;和时时刻刻的免疫调控。



个体化的免疫组库研究很快就可以用来做疾病相关性研究,寻找Bio-marker,对疾病机理进行一个全新角度的探讨。以前认为和遗传密切相关的很多“多 基因病”很可能就是免疫系统的疾病,可以通过研究免疫组库得到一些答案或线索。这些结果可以促进对更多疾病的早期诊断,治疗甚至预防。

通过跟踪疫苗免疫后免疫组库的变化,可以开发出更有效,更安全的疫苗。

免疫组库技术无疑也会成为新药开发的一个热门技术。




我们从07年开始做这方面的工作,有关专利也是两年前就递送进去了。我在新浪博客上也陆陆续续“透露”了不少有关的动向和有关免疫组库方面的学习和思考。不过用高通量测序方法研究免疫组库,我们并不是第一个发表论文的。今年在《科学》杂志发表了一篇用高通量测序技术研究鱼的免疫组库的文章,《血液》杂志两个月前也有发表用Solexa测基因组免疫组库的。几种方法的优缺点过段时间我再详细分析。感兴趣的大家也可以自己去把论文找来看。

我觉得我们方法的优势是信号扩增技术和使用454平台。一种方法如果要想得到更广泛的应用,需要使用简单,临床标本容易得到。技术的敏感性,包容性, 和定量能力是衡量免疫组库研究技术的硬性指标:10毫升血里面可能有五百万B细胞,两千万T细胞,考虑到免疫细胞的多样性,这10毫升血里面可能每个特定 的淋巴细胞仅有几个。所以扩增的方法需要敏感性极强(包容性好,最大限度地覆盖不同的免疫细胞),而且扩增过程和测序过程不破坏细胞间的比例(半定量): 不是高表达的得到更多的扩增,而数目较少的克隆细胞就被掩盖了。arm-PCR技术是成功的关键,我们能从一个标本里面扩增出17万个独特的分子,说明 arm-PCR技术的敏感性和覆盖性都非常好。

新一代高通量测序技术现在市场上站主导地位的有三个: 454, SOLiD, Illumina. 我们选择较贵的454平台是因为免疫大分子是重复性高,多态性(hypermutation, n-addition)极高,而且每个分子都可能是从新测序(de novo sequencing), 所以用读短分子的Illumina或SOLiD等平台就比较不适合。下一步,我们在继续进行基础研究的同时,也在尽快把方法转变成一个使用方便的工具,让更多的人能参与到免疫组库的相关研究中去。现在,这还是非常昂贵的实 验,一次454测序光试剂费用就可能上万美金。我们已经“烧”掉近一百万美金了(其它数据会陆续披露的)。

传统的免疫学是以抗原为中心的,试图从抗原找到抗体(或T细胞受体),有了免疫组库技术,Reverse Immunology 就成为可能:从大量的抗体(T cell receptors)信息出发,去寻找相应的抗原。

近代免疫学的主要技术是流式细胞仪。它可以让我们把免疫细胞细分,不同的发育阶段,不同的功能团体,都可以分离出来。但是再细分下去,分到单个细胞水平就 难了。arm-PCR加高通量测序给我们提供了进一步细分下去的能力,让免疫学家,生物学家看到以前所看不到的,看不全的。

免疫组库技术也可以看成是基因组技术的分支。但是它不是象GWAS那样扫描整个基因组来寻找遗传多态性和疾病之间的关系;免疫组库技术的研究重点就是免疫大分子(T 细胞受体,抗体,和HLA),就集中在基因组中的几个小点上。但是这几个位点却是人类基因组中最“活跃”的,决定着人如何与环境相互作用。传统基因组遗传学是在寻找疾病的”内因“;而免疫组库则是研究内因和外因的相互作用界面。

和基因组学,蛋白组学等一样,既然称为”组库“学,意思就是有高通量技术,有大量的数据。而且在方法学上也是:先有数据,再有假说 (传统生物学研究都是先有假说,再去设计实验,然后再证明假说)。

创新型科研和创新性技术(产品)类似,都是把现阶段最佳的技术和方法加以巧妙的整合,然后去解决一个前人没有解决的问题。把我们独特的arm-PCR技术 (论文中有详细介绍arm-PCR的原理)和新一代高通量测序相结合就拓宽了传统免疫学的视野;我们把arm-PCR和新的iCubate技术平台结合也 就给临床分子鉴别诊断增加了新的工具。

创业:
创业是加速创新技术和产品推广的最有效的方法。所以我们又成立了两个公司,iCubate 和 iRepertoire. 为什么成立两个公司而不是一个?因为一个是以做产品为主(iCubate)而另一个是以做技术为主(iR),商业模式不同。iCubate的研发工作已经取得了很好的成果;iRepertoire也已经取得了大量有意义的数据,但是产业化的步伐则刚刚开始。





历史常有巧合,二十年前我还在读博士的时候也是在PNAS上发表了一篇论文,介绍开发的一个新的给基因定位的技术(见二十年前的创新一文)。也是因为那篇论文,让我认识了我的生物技术创业导师Jim Hudson. 二十年后,我在他创办的研究院(HudsonAlpha 里面的Hudson就是Jim)从新开始新的一轮创新和创业。

另外,我还要强调团队的重要,我们实验室的Catherine Sanders (博士后)是读免疫专业的,更有丰富的免疫学实验基础;Qunying Yang则是从Genaco就跟我合作的做多重PCR实验的专家;Harry 是UAB免疫系主任,钻研免疫组库二十年;斯坦福那边的Elijiah,Baback等是美国使用454最早的一批科学家;前面提到的王春林博士不但是生物信息方面的专家,还是微生物和免疫出身的,论文的主笔是春林。整个团队缺一不可,配合得非常完美。

https://blog.sciencenet.cn/blog-290052-278408.html

上一篇:创业=养猪?
下一篇:一些有关免疫学的博文
收藏 IP: .*| 热度|

13 彭雷 许培扬 白桦 孙学军 张亮生 周春雷 刘立 孙永昌 柳东阳 张天翼 高建国 norman204 pkuzeal

发表评论 评论 (18 个评论)

IP: 123.126.82.*   | 赞 +1 [14]gaoshannankai   2013-12-12 15:12
这里个很重要的信息,你们测的序列,最后是从头拼接 还是mapping到人类基因组上,如果是mapping,那么illumina 150bp足够了; 所以我想应该是从头拼接,因为变异较大,mapping可以不起作用。是否??
回复  we do both.
2013-12-13 00:591 楼(回复楼主) 赞 +1 |
IP: 116.6.21.*   | 赞 +1 [13]卢森   2013-5-22 21:57
请问为什么是TCR,不是作BCR呢?BCR产生抗体啊,基本问题请教下。
回复  都做,继续读。www.irepertoire.com
2013-5-22 22:131 楼(回复楼主) 赞 +1 |
IP: 218.249.94.*   | 赞 +1 [12]李阳   2011-9-11 15:21
韩老师问点题外话:
斯坦福大学基因组技术中心的王春林博士自己研制科研程序,感觉好多外国科研人员可以自己按实际需要编制程序。他们是专门受过这些培训么?
回复  王博士在南大学分子生物,中科院学免疫,来美国伯明翰大学修生物信息博士。是个非常难得的人才。
2011-9-11 22:161 楼(回复楼主) 赞 +1 |
IP: 219.138.221.*   | 赞 +1 [11]laokanke   2011-8-1 23:31
哦,原来这就是原创,是自主创新,是开天辟地第一人,失敬!失敬!
难怪两弹一星不是创新呢,长见识了,惭愧!惭愧!
谢谢博主!
回复  谢谢您的“欣赏”。我完全没有诋毁“两弹一星”价值的意思,我们就事论事,讲创新和仿制的区别。
2011-8-2 00:291 楼(回复楼主) 赞 +1 |
IP: 166.111.152.*   | 赞 +1 [10][游客]ericaa   2010-2-25 23:45
请问arm-PCR在哪个专利数据库可搜索到,专利号多少,谢谢!
IP: 202.120.224.*   | 赞 +1 [9]张亮生   2010-1-15 12:30
韩老师PNAS文章已经刊登出来了,连接如下(国内都能下载的):
http://www.pnas.org/content/early/2009/12/22/0913939107.abstract?cited-by=yes&legid=pnas;0913939107v1
IP: 69.139.149.*   | 赞 +1 [8]廖新化   2010-1-4 15:13
“arm-PCR多重PCR技术扩增所有标本内的表达的重组VDJ”,是如何实现的?给个链接,我找不到。
博主回复:arm-PCR是一个专利(pending)技术,只有搜索专利库才能得到比较详细的方法介绍。也可以等PNAS论文出来再看里面的介绍。不过要想很好地了解arm-PCR, 最好的开头是先了解tem-PCR. google "templex, HPV, Jian Han"你会找到一篇我们06年发表的论文,详细介绍了那个多重PCR技术。这个技术后来卖给了Qiagen. 因为tem-PCR敏感性低些,时间长些,所以我们有研发了新一代的多重扩增技术(arm-PCR)。免疫组库需要更敏感的扩增方法。
IP: 159.226.238.*   | 赞 +1 [7]陈玺亦   2009-12-16 14:48
你大肆宣扬自己的论文 又到处游说你的创业理念,真的不知道你到底要干什么! 没有深度的人,总是这样!
IP: 202.120.224.*   | 赞 +1 [6]张亮生   2009-12-15 12:41
很受启发,虽然有很多词汇现在对于我还是陌生的。看着一个新学科开始,也真想参与进来。谢谢。
IP: 202.116.174.*   | 赞 +1 [5]赵晶   2009-12-15 00:46
韩老师果然 是niubious man,呵呵
博主回复:原来 “牛人”是这么讲,还害得我去查字典!哈哈。
IP: 115.170.153.*   | 赞 +1 [4]李庆祥   2009-12-14 23:24
congraduations
IP: 202.120.224.*   | 赞 +1 [3]solarwinds   2009-12-14 17:19
thank you very much.i think it is the most valua of science net
博主回复:thanks for your encouragement.
IP: 130.237.35.*   | 赞 +1 [2]徐磊   2009-12-14 16:56
Though I am not professionally in the field of immunity, since I am developing single molecule techniques for biomedical study, I will have interests to read your paper when it comes out.
博主回复:I heard at least two people in immunology (especially vaccine) are using single cell method to study immune repertoire. But nothing can replace single cell analysis, as we do not know the heterodimmer combination using our method.
IP: 222.201.156.*   | 赞 +1 [1]chtang   2009-12-14 11:50
good

1/1 | 总计:14 | 首页 | 上一页 | 下一页 | 末页 | 跳转

扫一扫,分享此博文

Archiver|手机版|科学网 ( 京ICP备07017567号-12 )

GMT+8, 2025-2-18 20:46

Powered by ScienceNet.cn

Copyright © 2007-2025 中国科学报社

返回顶部