八、诺贝尔奖见证丙型肝炎攻克

北京时间10月5日消息，2020 年诺贝尔生理学或医学奖揭晓：美国科学家Harvey J.Alter、英国科学家 Michael Houghton和美国科学家 Charles M.Rice 三人获奖，获奖理由：发现丙型肝炎病毒（图6-16）。

图6-16  获得2020年诺贝尔生理学或医学奖的Harvey J. Alter、Michael Houghton 和Charles M. Rice 

哈维·阿尔特（Harvey J. Alter），美国病毒学家，1964年与后来的诺贝尔奖得主巴鲁克·塞缪尔·布隆伯格发现了澳大利亚抗原。他还以动物模型来研究人体免疫缺陷病毒，并确定了丙型肝炎病毒。2000年获拉斯克临床医学研究奖，2013年获盖尔德纳国际奖。

迈克尔·霍顿（Michael Houghton），英国生物化学家，参与开发丙型肝炎测试。霍顿在白金汉郡塞尔研究实验室工作，在1982年成为希龙公司的非甲非乙型肝炎部主管。

查尔斯·M·赖斯（Charles M. Rice），美国洛克菲勒大学的病毒学教授，其主要研究领域是丙型肝炎病毒。他与Ralf F. W. Bartenschlager和Michael J. Sofia共同获得了2016年拉斯克-狄贝基临床医学研究奖。

从发现丙型肝炎病毒到治愈丙型肝炎，它的故事像一部经典悬疑小说的情节：先是令人费解的罪行，接着是对嫌疑人的漫长追捕，最后是对作恶者的严厉打击。尽管故事还没有结束，但人类战胜丙型肝炎的斗争，无疑是现代医学最伟大的成功故事之一。

（一）从“非甲非乙型肝炎”说起

长期以来，肝炎一直伴随着人类的历史。但直到20世纪，科学家才发现大多数肝炎病例是由感染肝脏细胞的病毒引起的。1963 年，美国国立卫生研究院糖尿病与消化及肾脏疾病研究所（NIDDK，当时称为“国家关节炎和代谢性疾病研究所”）的科学家发现了乙型肝炎病毒的一种主要蛋白质（HBsAg)，从此揭开了覆盖在这类患者头上的面纱；20 世纪 70 年代中期，美国国立卫生研究院过敏症和传染病研究所（NIAID）传染病实验室的哈维·詹姆斯·阿尔特（Harvey James Alter）研究团队鉴定出了甲型肝炎病毒。但是仍然有一些肝炎的罪魁祸首不为人知，当时将这种疾病称之为非甲非乙型肝炎。

那时候，乙肝患者对“α型干扰素”具有一定的效果，因此尝试用它来对抗引起非甲非乙型肝炎的未识别病毒。1984年，NIDDK 院内研究项目的科学家在马里兰州贝塞斯达的 NIH 临床中心对 10 名患者进行了干扰素初步研究。在 16 周的时间里，这些患者每天都要服用药物，并通过检测血液中是否出现肝损伤标记来监测他们的肝脏健康。研究人员很快就有了试验结果，而且颇具戏剧性：大多数患者的肝脏在一个月的治疗后显得更加健康。4个月后停止干扰素治疗，患者复发；然而，一旦重新开始治疗，他们的肝脏健康又再次改善，即使在剂量逐渐降低并在一年后停止治疗后仍保持正常。一些患者对干扰素治疗只有最小的反应，而另一些患者有反应但随后复发；但是，在最终长达 10 到 25 年的随访中，试验中有一半的患者没有显示出肝脏感染的迹象。他们是首批治愈这种疾病的患者。

尽管有这些初步的结果，但大规模的临床试验降低了人们对干扰素的期望，仅用干扰素治疗持续病毒学应答率（SVR）较低。当然，实现 SVR 的患者在停止治疗后至少24周内检测不到病毒，意味着治疗成功不复发的可能性非常大。当时，单独使用干扰素治疗的 SVR 通常低于20%。然而，干扰素与其他抗病毒药物的结合让研究者看到了希望。其中，干扰素和利巴韦林联合使用，显示SVR为30%到40%。另一个进展是科学家对干扰素进行了化学修饰，使其在人体内的持续作用时间更长。这种“聚乙二醇干扰素”（peginterferon）结合利巴韦林的方法SVR达到了55% 的率，成为了丙型肝炎患者的标准治疗手段。但另一方面，也经常伴随着副作用，如发热、疲劳、肌肉疼痛和抑郁等，这些往往限制了治疗的剂量和时间。

（二）丙型肝炎病毒的发现

其实，丙型肝炎病毒的发现在大规模干扰素之前。1989年，美国加州Chiron生物技术公司的生物化学家霍顿，与美国疾病控制和预防中心（CDC）的研究人员合作，在1989年的一篇里程碑式的文献中，Houghton及其团队首次分离出了非甲非乙型肝炎病毒的分子克隆，并一睹HCV的基因组：正链RNA病毒，基因组长度约为9500个核甘酸，所编码的长链多聚蛋白裂解为8-10个产物。该研究证实，这是一种新的病毒，现在的官方名称为丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）。

发现了这种病毒的发现在医学上具有里程碑意义，因为据此才能得以开发HCV的检测方法，并迅速应用于献血筛查。在接下来的几年里，随着检测技术的改进，丙肝病毒从输血供应中被有效消除。丙肝病毒的鉴定也促成了一系列后续的研究，确定了该病毒的分子结构。这对于设计专门与病毒成分相互作用，并抑制其复制的药物至关重要。病毒的鉴定还使研究者能更精确地诊断丙型肝炎，并理解其患病率；事实上，研究结果显示，丙型肝炎是西方世界最常见的慢性肝炎、肝硬化和肝癌病因。

HCV的发现是决定性的，但是这个谜题的另一关键部分尚未解答：单是病毒就能导致肝炎吗？为了回答这个问题，科学家们必须研究克隆的病毒是否能够复制并导致疾病。华盛顿大学圣路易斯分校的赖斯和其他研究 RNA病毒的小组注意到，在HCV基因组末端有一个此前未被识别的区域，他们怀疑该区域可能对病毒复制很重要。赖斯还在分离的病毒样本中观察到遗传变异，并推测其中一些可能会阻碍病毒复制。通过基因工程，赖斯获得了HCV RNA变异，其中包括新定义的病毒基因组区域，不存在失活基因变异。当这种 RNA 被注射到黑猩猩的肝脏时，在它们的血液中检测到了病毒，并观察到了与患有这种慢性疾病的人类相似的病理变化。这是最后的证据，证明HCV就可以导致不明原因的输血介导型肝炎病例。

利用新的直接检测技术对丙肝病毒进行检测，表明干扰素治疗降低了血液中的病毒水平；重要的是，对治疗有临床反应且没有复发的患者变成了HCV RNA阴性，他们的慢性病毒感染被治愈了。对血液中HCV RNA的检测是未来治疗的关键。研究表明，在停止治疗后的 12 周内持续没有发现HCV RNA，可以作为可靠的治疗终点。SVR 的数值成为了新疗法临床试验的基准，而批准一种新疗法的标准是，其产生的SVR 要高于利巴韦林结合聚乙二醇干扰素的疗法。

对丙肝病毒基因组成的研究表明，该病毒具有若干基因型（或基因变种），这些基因型决定了该病毒对治疗的反应效率。例如，基因型 1 是全世界范围内最常见的基因型，但临床试验发现，它对干扰素治疗的抵抗力比其他基因型更高。不同基因型的鉴定可以使研究人员更好地预测并定制治疗方法，这也解释了为什么一些临床试验参与者使用聚乙二醇干扰素的结果好于其他人。鉴定丙型肝炎病毒的另一个重要结果是，现在研究人员能够分析病毒的分子成分，并确定哪些可以成为理想的药物靶点。

（三）安全高效治愈药物的开发

HCV发现后，多家实验室确认，这些HCV蛋白中包括两种病毒酶，分别是非结构蛋白（NS）3-4A丝氨酸蛋白酶和NS5BRNA依赖性RNA聚合酶，两者均为极具潜力的HCV药物靶标。随后的研究，就是开发出新的HCV有效治疗药物。

药物开发的瓶颈是缺乏 HCV 细胞培养系统，但HCV 分子克隆带来了希望，这是因为正链 RNA 病毒的基因组具有传染性。将含有基因组 RNA 或等价的基因组 RNA的质粒导入受纳细胞，就会启动一个完整的病毒生命周期。这一方法在许多其他病毒上奏效，但应用于HCV时却失败了。最后，Kunitada himotohno和 Charles M. Rice的实验室发现了其中的原因：病毒基因组 3’末端缺失了一块。鉴于当时我们对 HCV 基因组已经完全了解，克隆出功能性互补DNA（complementary DNA）应该并不难，但如果没有细胞培养系统，如何对其进行检测？1997年，反映“共有”序列的克隆被用于筛选存在于人源性HCV中或实验室cDNA克隆期间获得的致死性突变。将该人工合成的裸基因组RNA注射至黑猩猩肝脏，随后出现了增殖性HCV 感染，并提供了首个遗传系统，这证实了可能的HCV特异性药物靶标对于该病毒至关重要。

在已有上述具有体内传染性的HCV基因组 RNA后，似乎可以预期合适的细胞培养系统将很快出现，然而情况并非如此。Ralf Bartenschlager实验室的工作解决了这一问题，其采用了从慢性感染患者肝脏克隆的另一种HCV共有基因组。还改造出了“选择性迷你基因组”，称为复制子（replicons），其用于分离支持稳定的HCV复制的罕见细胞。这些复制子编码可进行自主复制及产生细胞毒性药物G418 耐药所需要的最小病毒蛋白集合。通过药物选择，可以分离出支持 HCV长期复制的细胞。这一首个稳定的 HCV细胞培养模型重现了HCV复制周期的所有细胞内步骤，并且因为这些HCVRNA的复制依赖于病毒酶，最引人注目的是NS3蛋白酶和NS5B聚合酶，所以该复制系统适用于开发药物。

Rice和Bartenschlager随后开展的研究揭开了高效复制的原因。首先选择出细胞池中最为受纳 HCV 的单个细胞；其次，所选细胞克隆中的复制子含有突变，该突变可成倍地增强 HCVRNA 复制。将这些突变插入亲代复制子中，可对 HCV 复制进行直接测量。由此构建了首个广泛用于研究 HCV 生物学的遗传系统。随后Bartenschlager、Rice 等人改良了这一方法。

在已有稳定的 HCV 复制子全细胞系统后，制药和生物技术公司主要致力于HCV抑制剂研究，希望找到靶向抗病毒药，并最终替换当前HCV感染的标准治疗，即干扰素注射和利巴韦林的联合治疗，该联合治疗可能导致重度不良反应，治愈率不高，并且基因型覆盖范围有限。

2005年，HCV药物研发的努力集中于数种关键病毒靶标，包括 NS5B RNA 依赖性 RNA 聚合酶（NS5B RdRp）。Pharmasset公司的HCV复制核苷抑制剂研究确认了一种独特的2′-α-F-2′-β-C-甲基胞苷衍生物 PSI-6130（一种HCV 抑制剂）。针对HCV RdRp的核苷靶向药物有望提供更为广阔的基因型覆盖范围，并防止病毒耐药性的出现。该核苷在复制系统中显示出 HCV 抑制作用，相比其他病毒对HCV有高度选择性，显示出泛基因型特征，并且证实具有高耐药基因屏障。但是 PSI-6130 缺乏足够的口服生物利用度资料，其代谢后形成了大量非活性尿苷，因此到达靶标的活性药物有限。

经初步尝试改善PSI-6130 后，开发出了 PSI-6130 前体药物。在临床研究中，PSI-6130 前体药物验证了这一概念，即 2′-α-F-2′-β-C- 甲基胞苷在患者中抑制 HCV，并且是首次对非基因型 1 患者有效的直接作用抗病毒药物。但是该候选药物的局限性也很明显，需每日两次大量给药才能显示出疗效，并且非活性尿苷代谢物仍然存在。

为解决 PSI-6130 前体药物的这一不足，Sofia 及 其同事对该核苷抑制剂进行了彻底的再设计。研究显示该尿苷代谢物的三磷酸盐是 HCV RdRp 的强效抑制剂，并在人原代培养肝细胞中展现出较长的半衰期。三磷酸盐半衰期越长，细胞内的活性药物浓度则越高。已经确定的是，阻断尿苷至活性三磷酸盐的代谢转化过程可引起其活性缺乏。该阻断作用特异性针对尿苷至单磷酸盐中间产物的转化过程。

为解决将高电荷、不稳定且不能透过膜的单磷酸尿苷运输至细胞，并最终进入机体的问题，提出了“特洛伊木马”策略，即通过掩蔽单磷酸尿苷达到增加稳定性并促进转运至机体和肝细胞的目的。在进入肝细胞后，该“掩蔽物”需要脱离，以暴露出单磷酸盐，之后细胞将其转化为三磷酸盐抑制剂。同时，该掩蔽物还被设计为借助肝首过效应以促进药物的肝靶向作用，即利用肝酶选择性地移除掩蔽物，并最终将该药物转移至肝细胞内。

在大量体内外临床前开发中，评价了多种经过掩蔽的单磷酸尿苷，最终选择了临床候选药物 PSI-7851。之后在一项短期研究中，PSI-7851 在接受每日一次给药的 HCV 患者中显示出高效性，并且未观察到任何药物相关不良事件或者耐药。这一结果提供了肝靶向单磷酸尿苷前体药物的概念验证。在一项名为“Electron”的里程碑式临床研究中，PSI-7977（PSI-7851 的单一同分异构）和利巴韦林联合用药 12 周在 HCV 基因型2和 3 的患者中显示出了100% 的治愈率（定义为治疗完成时持续病毒学应答）。这一结果为临床医生如何治疗 HCV感染患者提供了一种新方法，医生无需再注射干扰素。PSI-7977（现称为索菲布韦）联合利巴韦林的3期临床研究证实了高治愈率，随后索菲布韦联合利巴韦林被美国食品药品管理局批准用于 HCV基因型 2和3的患者。但是索菲布韦联合利巴韦林在HCV 基因型1的患者中并未达到较高的治愈率。

在开发出含有选择标记和报告基因的报告复制子后，可以进行数百万化合物的高通量筛选，由此发现了一种新型、极强效的 HCV 抑制剂，即NS5A抑制剂。该报告复制子的开发证实了复制子系统的多功能性，并发现了缺乏酶活性的特殊药物靶标。随着NS5A 抑制剂和下一代 NS3-4蛋白酶抑制剂的进一步开发，现已可以开展针对索菲布韦联合用药的临床研究。之后还批准了多种基于索菲布韦的联合用药用于治疗 HCV，包括首个单片、固定剂量的索菲布韦和雷迪帕韦复方制剂，其在HCV基因型1感染患者中显示出超过95%的治愈率。

从确认引起肝损害的病毒到安全且高效治愈HCV花费了24年（图6-17）。随着时间的推移，HCV感染必定会被冠以罕见病的称号。

图6-17  HCV抗病毒治疗的历史回顾