2019Nature Reviews | Microbiology：Common principles and best practices for engineering microbiomes

2019Nature Reviews | Microbiology：工程微生物组的通用原则和最佳实践

Christopher E. Lawson 1*, William R. Harcombe 2, Roland Hatzenpichler 3,4,5,
Stephen R. Lindemann 6, Frank E. Löffler 7,8, Michelle A. O’Malley 9,10,
Héctor García Martín 10,11,12,13, Brian F. Pfleger 14, Lutgarde Raskin15,
Ophelia S. Venturelli14,16,17, David G. Weissbrodt 18, Daniel R. Noguera1,19
and Katherine D. McMahon 1,17*

1美国威斯康星大学麦迪逊分校土木与环境工程系。

2美国明尼苏达大学圣保罗分校生态学、进化与行为学系。

3蒙大拿州立大学化学与生物化学系，美国蒙大拿州波兹曼市。

4美国蒙大拿州立大学生物膜工程中心。

5美国蒙大拿州立大学热生物学研究所。

6美国普渡大学西拉斐特分校食品科学系。

7美国田纳西州诺克斯维尔田纳西大学环境生物技术中心。

8生物科学部，橡树岭国家实验室，橡树岭，田纳西州，美国。

9美国加利福尼亚大学圣巴巴拉分校化学工程系。

10Doe联合生物能源研究所，加利福尼亚州埃默里维尔，美国。

11美国加利福尼亚州伯克利劳伦斯伯克利国家实验室生物系统和工程部。

12Doe Agile生物基金会，加利福尼亚州埃默里维尔，美国。

13巴斯克应用数学中心，毕尔巴鄂，西班牙。

14美国威斯康星大学麦迪逊分校化学与生物工程系。

15密歇根大学土木与环境工程系，美国密歇根州安娜堡。

16美国威斯康星大学麦迪逊分校生物化学系。

17美国威斯康星大学麦迪逊分校细菌学系。

18荷兰代尔夫特科技大学生物技术系。

19Doe大湖区生物能源研究中心，麦迪逊，威斯康星州，美国。

摘要：尽管人们对利用地球微生物组的力量有着广泛的科学兴趣，但知识差距阻碍了它们有效地用于应对紧迫的社会和环境挑战。我们认为，围绕设计-建造-测试-学习（DBTL）循环，形成研究和技术开发体系，将推进微生物组工程，并促进控制微生物组功能的基本科学原理的新发现。在这篇综述中，我们提出了微生物组工程中迭代DBTL循环的关键要素，重点介绍了普遍方法，包括自上而下和自下而上的设计过程、合成和自组装的构建方法，以及分析微生物组功能的新兴工具。这些方法可推动微生物组在医药、农业、能源和环境方面的广泛应用。我们还讨论了每种方法的关键挑战和机遇，并将其综合为工程微生物组的最佳实践指南。我们预计，DBTL框架的应用将迅速推进以微生物组为基础的生物技术，旨在改善人类和动物健康、农业和促进生物经济。

专业词汇

微生物组学（Microbiome science）：发现和检测控制微生物组组装和功能的基本原理。

微生物组工程（Microbiome engineering）：利用基本的科学原理和定量设计，创造出具有所需功能的微生物组。

共营养（Syntrophy）：一种有义务的互惠过程，由两个或多个有机体之间的代谢物交叉喂养介导，不能由一个有机体单独催化。

宏表型（Metaphenotypes）：由单个微生物基因组（宏基因组）之间的相互作用及其与环境的相互作用而产生的微生物组的新兴功能。

生态工程（Ecological engineering）：设计和操作生物反应器和其他工程系统的过程，以促进能够发挥预期功能的特定微生物群落的发展。

功能团体（Functional guilds）：使用相似资源（例如，电子供体、电子受体或碳源）并占据相似生态位的物种群。

关键种（Keystone species）：

对维持微生物组的功能和微生物相互作用（微生物之间及与环境间）有特别大影响的物种。

通量平衡分析（Flux balance analysis）：一种基于约束的数学建模技术，利用基因组信息重建代谢网络以模拟代谢通量。

集合建模（Ensemble modelling）：通过模拟一组可能性并选择与测量数据一致的，即使用多个模型来解决不确定性问题。

机器学习（Machine learning）：用于建立预测模型的技术，通过样本数据得到模式和推论，而不是明确的或机制的关系。

技术经济评估（Technoeconomic assessment）：通过工艺设计、建模和经济评估相结合的方式，对综合工艺的技术和经济可行性进行评估的工具。

生命周期分析（Life cycle analysis）：用于评估与产品生命周期所有阶段相关的环境影响的工具，如能源和水的消耗，以及空气污染物和温室气体的排放。

自组装微生物组（Self-assembled microbiome）：通过环境操作选择所需功能而建立的微生物组。

合成微生物组（Synthetic microbiome）：通过组合预先确定的纯化或富集培养物以实现所需功能而构建的微生物组。

整合和结合元件（Integrative and conjugative elements）：可移动的遗传元件能够通过位点特异性重组整合到DNA位点，该重组携带编码结合所需机制的基因。

外代谢组学（Exometabolomics）：一种分析技术，通常通过气相/液相色谱-质谱或核磁共振波谱测量环境和/或生物样品中细胞外小分子代谢物。

废气分析（Off-gas analysis）：生物系统产生的气体流速和化学成分（例如二氧化碳、氢气、甲烷）的监测。

结构-功能关系（Structure–function relationships）：微生物组的三维空间组织对其功能的影响。

广义Lotka-Volterra方程（Generalized Lotka–Volterra equations）：基于实验推断的物种相互作用参数，用来表示种群动态的一组常微分方程。

基本生态位（Fundamental niche）：物种能够生存和繁殖的一整套环境条件（即在没有种间竞争的情况下物种的生态位）。

现实生态位（Realized niche）：考虑到种间竞争（竞争、捕食等因素）后，一个物种所使用的环境条件集。

微生物群落似乎有着无限的能力，驱动着地球的生物地球化学循环，占据着每一个环境生态位。工程师和科学家长期以来一直在利用这一能力，例如，通过操纵土壤微生物组提高作物生产力3，通过刺激自然产生的或引入的微生物组来修复受污染的地下水4，或通过建造反应器微生物组来从废水中回收宝贵的资源5。尽管这些成就突出了微生物组的宝贵功能，但微生物世界的绝大多数转化能力尚未被释放和利用。由DNA测序驱动的最新研究揭示了未培养微生物的高度遗传多样性及其在多种生态系统中的关键作用6,7，为潜在的新生物技术应用提供了一个窗口。

认识到这一未被发掘的潜力，资助机构和国际科学界呼吁全球努力推进微生物组研究8,9。这些倡议已经认识到微生物组学需要超越描述性研究，采用一种系统方法，产生机制的、可预测的和可操作的理解，从而使合理的微生物组学工程8成为可能。

然而，由于缺乏对微生物组进行详细功能研究的可操作实验系统，大量的微生物组基因和代谢物功能尚不清楚，微生物之间的许多相互作用（例如，共营养作用）未被表征11，没有足够的工具来精确地测量和模拟微生物在时间和空间上的功能，以及精确操纵微生物结构和功能的方法的有限可用性，因此无法实现这一转变。

将基础科学发现与工程相结合可以克服这些挑战，并开发出支持可持续自然资源管理和人畜健康的创新解决方案。特别是，工程方法可以用来创建实验系统，允许测试概念知识和提取促进微生物组研究的新知识。为了加速科学发现和转化为创新解决方案，我们建议微生物组工程采用迭代设计-构建-测试-学习（DBTL）循环来形成研究和技术开发过程体系。该循环包括开发初始微生物组设计或初步模型系统，以实现规定的工程目标，构建微生物组，根据一组规定的指标测试其功能，以确定设计-构建解决方案是否产生设计目标（即，确定因果关系），学习哪些有用，哪些没用（以及为什么），并将新知识纳入后续DBTL循环的决策过程（图1）。这一方法已成功地应用于制造业12、代谢工程13和创业（“构建、测量、学习”）14，并能迅速提高我们开发急需工具和设计概念的能力，以利用微生物、提供创新解决方案和提高科学知识。

在这篇综述中，我们提出了一种迭代的DBTL方法的关键要素，该方法可用于促进微生物组的合理工程化，以实现有益于社会的功能。我们回顾了在医疗、农业、能源和环境应用中利用微生物组的各种方法，并确定了与实施每个DBTL阶段相关的当前挑战和机遇。最后，我们讨论了DBTL循环如何应用于建立微生物生态系统基本原理的模型系统，并展望了微生物组工程的前景。

设计微生物组（Designing microbiomes）

由于分子尺度微生物组工艺的高度复杂性和有限的理解，微生物组设计传统上遵循自上而下的方法。这种方法试图预测生态系统水平的控制如何创造出具有所需功能的微生物组。然而，多组学的最新进展为自下而上设计微生物组提供了机会，通过预测代谢网络如何控制及其相互作用创建具有所需功能的微生物组。这些方法结合起来，提供了为特定工程目标设计微生物组的互补策略，特定工程目标包括从可持续的废水处理到治愈与微生物组相关的人类疾病等。

自上而下的设计（top-down design）

自上而下的方法不是预先决定哪些物种和详细的代谢途径，而是使用精心选择的环境变量（例如某些底物负载率、平均细胞保留时间和氧化还原条件），通过生态选择强制现有微生物组（自然发生或接种）以执行所需生物过程（或“宏表型”）15（图2）。这里，“上”是指发生所需生物过程的生态系统，“自上而下的设计”是指用于预测生态系统的物理、化学和生物过程（即生态系统过程）的操作如何获得所需功能的方法。生态工程原理16（也称为微生物资源管理17或微生物群落工程18）为预测如何操作生态系统提供了信息。这要求工程师将系统概念化为一个生态系统模型，该模型捕捉系统输入和输出、物理化学条件（pH、温度、氧化还原电位等）、已知的非生物和生物过程以及环境变量，以及它们的操作如何促进或抑制生物过程的优化19，20。随后，利用数学模型对系统中的化学物质和相关微生物进行质量平衡分析，并模拟化学和生化转化率。这些过程模型通过表征具有特定化学计量参数（生长和产物产量）和动力学参数（最大比生长速率，底物摄取率和底物亲和力）的微生物（例如产甲烷菌、发酵罐、硝化菌或光养生物）的关键生理或功能性团体捕获微生物功能21-23。这些模型还可以综合描述作用于化学物质和微生物的三维物理输运过程（扩散、平流和扩散），这在空间结构系统（如生物膜24、25）中尤为重要。

自下而上的设计（Bottom-up design）

尽管传统的微生物工程自上而下的设计方法为宏观过程提供了框架，并在废水处理21和生物修复4方面取得了广泛的成功，但是它常常忽略了驱动微生物和相关化学转化的复杂的原位代谢网络26，忽略了依赖于群落成员之间复杂相互作用的过程；例如，通过物种间直接电子转移的共营养相互作用27。因此，在设计过程中往往忽略了分子尺度的微生物组过程，限制了通过分子尺度机理分析的系统优化。多组学和自动化技术的最新进展（例如，在宏基因组学和微流体学中）使研究人员能够开发自下而上的方法，并将研究重点放在设计微生物组的代谢网络和微生物相互作用上。这里，“下”是指微生物组中单个物种的代谢网络（从它们的基因组中表达出来的），而“自下而上设计”是指用于预测通过这些相互作用网络的代谢流量如何产生所需输出的方法。一般的设计过程是获取微生物组的单个成员的基因组28（尤其是关键物种29，如果知道30），重建它们的代谢网络31，32，并使用建模33和/或网络分析工具34来指导设计（图2）。现有的基于约束的方法，如通量平衡分析提供了一个合适的框架，用于探索使用定量模型哪些化学转化的组合是可能的，其中个体种群的反应和代谢物可以被划分，并且可以使用最优性原则模拟种群内和种群间的代谢通量35。这些模型还可以模拟随时间和空间变化的稳态通量分布36,37，并且可以集成到基于过程和/或基于个体的模型中38，以预测宏表型、自组织空间模式和其他新兴行为。这种自下而上的工具为工程师提供了一个计算框架，以便系统地评估驱动生物过程和生态相互作用的代谢网络，并为合理设计具有特定特性的微生物组提供了一个平台，例如分布式路径39、40、模块化物种相互作用41，优化生态系统功能和稳定性的群落抵抗力和恢复力42和时空组织43。然而，大多数自下而上的设计实例都是用具有工程依赖性的模式生物（如大肠杆菌和酿酒酵母）构建的简单群落。因此，将这些设计扩展到具有数十到数百种不同物种的非模式生物体的系统，将需要对它们的新陈代谢以及控制它们相互作用和高阶行为的原则有更深入的了解。实施自下而上设计面临重大挑战，包括代谢网络重建不准确和/或不完整，许多基因、蛋白质和代谢物的功能未知，驱动个体和群落水平表型的进化压力缺乏理解，对基因、代谢和生态系统调节体系（例如，群体感应信号-响应系统）的理解有限44。这些限制导致了模型的高度不确定性，因为路径化学计量和酶动力学的关键限制要么不适当，要么缺失，目标函数无法捕捉细胞行为的真正进化驱动力45，最终导致原位宏表型预测不佳。作为自下而上设计的起点，可以从基因组注释和已知的生理信息中重建捕获中心碳和能量代谢的核心代谢模型。这些模型最初的预测能力可能有限，因为它们忽略了调控信息、途径动力学、次级代谢和进化。然而，当这些知识被获取并通过多个测试和学习周期被纳入代谢模型时，系统功能的准确预测（例如，代谢通量和代谢产物交换）可能会出现。作为一种补充方法，数据驱动建模技术，如集成建模和机器学习，可以提供更快速的方法来预测微生物组的代谢过程，或获得微生物组建模所需的约束和参数，而无需对代谢调节进行详细的机制理解46,47。这些模型框架已被用于从蛋白质组和代谢组数据预测途径通量48，通过基于集成模型的通量平衡分析改进代谢物交叉喂养预测49，并获得代谢模型所需的关键催化周转数50。虽然这些方法足够灵活、普遍，可应用到微生物群落，但是他们仍需要大量的单个菌株和互作群落代谢的实验数据。这些信息可以从以前的测试阶段（例如，从高通量的表型筛选和多组学）中利用，以允许数据驱动的设计。

综合设计（Integrated design）

展望未来，我们认为，成功的微生物组设计需要自上而下和自下而上的方法的合理平衡，特别是当我们处理复杂的微生物组时，如人类微生物组或活性污泥（图2）。混合方法可以包括选择未定义的混合物和已定义的菌群以实现所需的微生物功能，将基于过程的模型与从宏组学信息重建的自下而上的代谢模型合并以模拟生态系统过程、质量平衡和代谢物通量，并使用基因组衍生信息来开发群落选择策略。在设计中获取高阶特性，如功能稳定性和动力学，可能还需要自上而下和自下而上的方法来收敛。特别是，利用代谢框架量化功能退化、生态位互补和网络缓冲机制的新数学建模方法51可使微生物组多样性得到优化，以维持原位所需功能。更全面地描述微生物组代谢的需求将取决于具体的工程目标和生态系统的易处理程度。例如，可能需要更详细地描述厌氧微生物组的代谢，以将生物量转化为特定的商品化学品，而不是甲烷，因为需要更好地控制代谢。在这两种情况下，设计阶段都包括定义工程问题、开发概念和定量模型、确定要操作的关键生物过程以及评估多个候选设计方案。

图1 |微生物组工程的设计-构建-测试-学习循环。介绍了设计-构建-测试-学习循环每个阶段的关键方面和方法。该循环从一个确定的工程目标开始，该目标确定了设计并产生了一个执行所需功能的工程化微生物组。

实用的设计步骤（Practical design steps）

在设计微生物组，特别是复杂微生物组时，有五个关键步骤：定义工程问题、开发概念生态系统模型、创建定量模型、确定要工程化的微生物组过程以及开发和评估候选设计策略。为了推动DBTL循环，必须明确定义问题及建立具有可测量的设计目标。这些目标可以具体说明期望的结果，例如产品的滴定度、速率和产量、污染物去除效率、作物生产力或功能稳定性和鲁棒性的程度。

设计目标应辅以技术经济评估和/或生命周期分析，以确保解决方案在经济上可行，并具有积极的环境和社会影响52,53。概念生态系统模型可用于将问题置于上下文中，这些模型捕捉了系统边界、输入和输出、碳和养分流动的主要途径、导致这些转化的关键物种和种间相互作用以及影响其活动的因素（例如，pH、温度、氧化还原电位和停留时间）19。它们提供了一个概念图，描述了目前对微生物组与生态系统物理、化学和生物组成部分之间相互作用的理解，有助于确定系统理解和数据收集需求方面的重要差距。在这个阶段，所有相关的信息应该从文献中收集，现有的数据（例如，来自人类微生物项目）54和在线数据库（例如，MiDAS（活性污泥微生物数据库）55用于生态系统表征。这包括关键生物的参考基因组和生理信息、以前的多组学数据集、生态系统的物理化学特性（如pH、温度和化学浓度）和过程（如光化学反应和水文地质过程）、场地特征（如养分负荷和动力学，土壤剖面和肠道解剖）以及描述生态系统所需的所有其他信息。缺失的信息，例如未知的生化途径和介导它们的生物体，可以在构建、测试和学习阶段作为目标。这一概念生态系统模型可供科学界用于提出和检验理论，并作为开发定量模拟工具的路线图。建立能够计算和模拟代谢通量、微生物丰度、质量平衡和生态系统物理化学参数的定量建模工具，对于微生物组的系统设计至关重要。可以使用几种方法来创建此类模型，包括机理代谢建模33、基于过程的建模21、数据驱动的建模（例如机器学习）48和基于个体的建模38或其组合。无论采用何种方法，复杂微生物组的模拟都可能需要基于实验有效假设的简化。简化可以包括将模型简化为一组代表重要功能团体并控制主要碳和能量流动的核心或关键物种，或者将物种的代谢网络规模缩小为中心碳和能量代谢。展望未来，重要的是确保模型在构建-测试-学习循环中经过严格的实验验证和迭代，以提高其在微生物组工程中的实用性和广泛应用，并确定建模工作失败的时间，揭示概念理解上的差距，从而进一步促进模型的重新设计和改进。定量微生物组建模（如动态流量平衡分析）有助于确定需要直接操作、添加或移除以实现预期工程目标的核心和外围生化途径。目标可以包括增加丁酸产生和不消化碳水化合物被人类肠道中发酵细菌降解，在淡水生态系统中通过蓝藻防止毒素生物合成或通过生物强化有机卤化物呼吸细菌刺激有毒氯化物的降解。微生物组学建模可以预测环境（如底物负载、pH值和固体保留时间）或基因操作（如基因敲除、途径添加和强制依赖）如何优化微生物组学功能以实现工程目标。如有必要，可设计合成微生物以改善微生物组的功能。这种合成微生物将需要评估它们在相关环境条件下与现有微生物组成员合作和竞争的能力。

图2 |自上而下和自下而上设计微生物组的方法。左面板说明了从分离物开始的自下而上的设计流程。对单个物种进行生理特性分析，并利用代谢模型为期望的功能（从深蓝化合物中产生浅蓝化合物）设计群落。基因工程和合成生物学策略被用来优化系统功能（识别基因编辑目标，重设远离毒素（紫色）和朝向所需的产品的代谢流路径；毒素报告菌株的设计）。右面板说明了一种自上而下的设计，首先是一种含有环境中未培养微生物的接种物。对未定义的微生物组进行群落特征描述，并利用生物过程建模（包括动力学和微生物生长在内的质量平衡分析）来制定选择策略以实现所需的功能（从深蓝色化合物中产生浅蓝色化合物）。生物过程工程（例如，反应器设计）用于优化系统功能。中间面板显示了自上而下、自下而上的集成设计。选择未定义群落和已定义培养物的组合以实现所需的功能。进行群落特征描述，并将基于过程的模拟与代谢模拟相结合的微生物组建模用于制定选择策略和分析微生物组代谢通量。微生物的形状代表了设计过程中选择的不同分离物或群落。OD，光密度；S，底物。

构建微生物组（Building microbiomes）

构建阶段包括物理组装设计的微生物组，或通过自上而下操纵自然群落（即自组装微生物群）或通过自下而上使用自然发生或工程微生物（即合成微生物组）的纯化或富集培养物组装。构建阶段旨在实现设计规范和预测。

通过自组装构建（Building by self-assembly）

自组装微生物组可能包括那些使用反应器工程（例如，废水处理生物反应器）或生物刺激（例如，添加到土壤、沉积物或地下水含水层）作为开放混合培养物构建的微生物组，其中，构建创造了一个环境，促进土著微生物的生长和期望活性。例如，操纵反应器流体动力学，将生长缓慢的微生物固定在致密颗粒中，使其得以保留和增殖56,57，使用非人类可消化的碳水化合物刺激肠道发酵产生短链脂肪酸58，或添加电子供体，在有毒氯污染的生物修复过程中驱动有机卤化物呼吸细菌的代谢。当功能团体之间的生理和物理化学性质的差异可以通过环境操纵（例如，生长速率59、主要电子供体和受体4、60、底物亲和力、细胞和/或生物膜密度61和氧化还原梯度的差异）来进行组装时，这种方法非常有效。然而，当需要对微生物代谢和相互作用进行更精细水平控制时（例如，控制复杂的竞争性相互作用62、以高产量和纯度生产有价值的生物产品63或以多种生活方式控制物种64），这一点可能会受到限制。

此外，进化工程的新策略已经成为构建自组装微生物组的潜在工具。在多个选择周期和/或制度下控制初始微生物组的暴露会导致微生物组通过适应或进化获得或优化特定功能。例如，连续地转移使植物性状最大化的微生物组已经产生了增加植物生物量65和开花时间66的微生物组。对群落水平选择的响应通常由单个物种的富集或适应所驱动67,68；然而，对群落生物量生产的选择也被证明能增强所定义的两个物种和三个物种共培养中所需的物种相互作用37,69。重新检查选择实验，以了解突变和/或适应改变微生物组表型的时间和方式，可以阐明微生物组适应度优化和信息设计的潜在机制，正如在实验室进化实验中大肠杆菌所示70,71。由于类似的进化方法（例如，适应性实验室进化）也已成功应用于代谢工程菌株的优化72，将已经为单个微生物开发的实验和计算协议扩展到微生物组可以简化设计阶段，减少完成进化实验所需的时间。

构建合成微生物组（Building synthetic microbiomes）

使用纯化或富集培养物直接构建微生物组也是有希望的，因为降低了复杂性和使用遗传易处理和/或特征良好的微生物。这种自下而上的方法使得越来越多的合成生物学工具可以用于微生物组的构建和优化。早期直接从培养的微生物中构建微生物组的一种方法是生物强化。在这里，定义的实验室菌群被添加回环境中，以提高特定污染物的降解率。一个成功的例子是添加含脱卤球菌纲有机卤化物呼吸细菌的菌群到污染的地下水含水层和沉积物，以加速有毒氯化污染物的降解。这一方法成功的关键在于详细了解关键脱氯菌与其他微生物及地球化学环境的生理学、营养需求和潜在的生态相互作用4。然而，与氯化污染物的成功相比，生物强化方法在溢油事故中基本失败。与有机卤化物呼吸性脱卤球菌成员不同，其填补了一个独特的生态位，没有氯化污染物就无法生长，能够降解油烃的生物体（特别是需氧菌）无处不在，代谢多样，生长不依赖于特定的底物或氧化还原对64。这种代谢的多功能性限制了它们在生物强化中的应用，因为它们不可预测的原位活性。生物强化可能失败的其他原因是，未经确认的互惠相互作用和执行关键功能的微生物缺失（例如，生产多糖表面活性剂以提高碳氢化合物的生物利用度）73，或者在实验室条件下选择的菌群在苛刻条件和/或可变现场条件下不再具有足够的竞争力74–76。这些例子突出表明，需要更好地了解合成菌群的相互作用网络，特别是支持相互作用（次要功能）的功能，以及在复杂生态系统中往往难以预测的原位竞争环境。尽管自下而上构建微生物组和从特定栖息地收集培养微生物的呼声越来越高77,78，但大多数与人类健康、农业和环境应用相关的微生物仍然未培养、特性差、遗传上难以控制且难以维持，使合成微生物组的构建具有挑战性。为了捕获这种非特征化的代谢多样性，需要创新的分离和控制微生物组组装的技术，例如，单细胞分选79与高通量培养（培养组学）80、81相结合，并在多个条件下并行分型82、83。微流体84,85（即，微升液滴的产生和操作）可以促进这种方法。微流控芯片可以通过液滴组合86、消除特定物种87、测序和单个细胞的多组学分型，自动组装和分析纯化或富集培养物中的微生物群落。结合新的基因编辑技术，例如提高了基于同源重组的基因编辑效率的基于CRISPR基因组工具90，91,92，微流控技术还可以自动化合成生物学技术，用于具有新功能的细胞和微生物组的工程93。

合成微生物的另一个挑战是在实验室或开放系统（例如人类肠道、土壤和废水处理厂）中保持其功能的稳定性，这些系统易受自然微生物和动态异质环境的入侵。如前所述，有机卤化物呼吸性脱卤球菌成员生物强化成功的主要原因是他们高度专业化的生活方式，使他们能够利用氯化电子受体占据开放的生态位。然而，在开放系统中具有多种生活方式的物种的功能稳定性是不可预测的。很少有研究考察开放系统中合成菌群的功能稳定性，而合理设计稳定的生态相互作用所需的知识是有限的。然而，工程菌已经成功地在哺乳动物肠道中作为诊断传感器部署了200天，维持了强健的功能94,95。这一壮举，再加上脱卤球菌4的生物强化实例，证明只要关键参与者能够与土著微生物竞争，合成菌群就可以与先前建立的群落成员形成稳定的微生物组。自组装微生物组的观察结果表明，构建具有时空组织的群落对于获得稳定和多功能的合成微生物组具有重要意义。高度多样的微生物群落，如人类微生物群或用于废水处理的微生物群，以生物膜、絮体或颗粒的形式自组装，包含多个单一物种的微菌落，通过物种特定的胞外聚合物质（包括多糖、蛋白质和DNA）和其他不明确的大分子（如腐殖质）96，97连接在一起。这些自组织微生物组合创造了不同的微环境和生态位，支持看似不相容的功能（例如，好氧和厌氧过程）98、99和可以补偿干扰的功能多样的种群结构，例如营养物质的变化，物理化学条件或捕食的变化100，101。尽管将这种精细水平和复杂的结构构建成合成微生物组尚处于萌芽阶段，但基于微流控的系统已被用于通过控制空间结构和化学通讯来组装简单的群落，从而提高功能稳定性102。此外，三维生物打印平台可以允许构建空间组织系统，其中种群可以物理分离，同时保持化学互作103，104。如何将这些空间上定义的结构从实验室试验系统扩展到实际应用仍有待解决，尽管从模型系统（如合成多糖颗粒）105，106的测试和学习阶段获得的知识应提供更多的见解。在此之前，现有的基于自上而下组装和/或工程生物膜载体媒介107的方法可用于构建具有更大稳定性和功能性的自组织化合成微生物组。在复杂环境中可靠地执行感知-计算-响应程序的工程宿主中设计合成基因回路也仍然是一个主要的挑战108。因此，研究自然生态系统和工程生态系统中决定微生物组稳定性和适应环境扰动的分子机制，以提取可用于合理工程化稳健功能的设计原则，具有重要意义。鉴于基因工程微生物和微生物组在各种开放环境中的潜在用途，未来诸如生物封闭系统（例如两层基因回路和必要的合成营养缺陷）109等保障措施也需要进一步发展，并需要作为使用基因修饰物种构建合成微生物组的组成部分。

整合方法（Integrating approaches）

合理微生物组设计的最终目标是开发工具，使工程师能够在一系列理想的操作条件下，直接在原位添加、移除或修改特定的功能和表型。一种新兴的技术，有望实现这种灵活性就是原位宏基因组工程110， 111，这涉及到工程化移动遗传元件输送到土著微生物。例如，利用整合和接合元件工程化的供体菌株，已将携带报告基因和抗生素抗性基因或多基因途径（例如，固氮基因（nif）簇）112的DNA转移到高度异质性和多样性环境中的细菌，例如土壤112和哺乳动物肠道111。与现有的CRISPR-CAS基因编辑技术相结合，这种工具的进一步开发将允许精确地操纵微生物基因组的代谢网络，有效地结合自组装和合成微生物组（方框1；图3）。

测试微生物组功能（Testing microbiome function）

测试阶段包括测量微生物组的相关表型和特性，以确定设计-构建解决方案的有效性。测量应确定是否达到了设计结果（例如，测量生物产品的滴定度、速率和产量、污染物去除效率或作物生产率），以及设计-构建解决方案是否对观察到的结果负责（确定因果关系）。这通常需要读取生态系统的物理化学性质（如pH、温度和化学浓度），以及关键生态系统过程和微生物组功能（如生物量增长、化学转化、养分同化和代谢通量）的化学计量和动力学。例如，在厌氧消化微生物组中，乙酸降解率和甲烷途径可使用13C标记的乙酸和在线沼气分析进行测试，测定乙酸产甲烷相对于共营养的乙酸氧化耦合氢气产甲烷的流量113。虽然在测试过程中测量的微生物粒级将取决于特定的设计目标和生态系统复杂性，量化分子微生物过程的能力（例如，代谢途径率和路线，酶活性和单个有机体生长速率）超出了批量活性的测量范围，并允许对观察到的微生物组功能的特定机制进行测试。面临的挑战将是开发出高通量、定量、价格合理且易于使用的工具，以便能够在时间和空间以及动态条件下完成微生物组的常规分析。为了实现这一目标，我们设想了一个测试阶段，包括高通量微生物组设计表型筛选-构建解决方案，然后使用多组学和代谢通量分析对有前景的解决方案进行更深入的研究，以获得对潜在机制的更深入了解（图4）。利用液滴微流控技术可以实现对构建的微生物组的高通量表型检测，最近已证明可用于筛选约100000个合成群落114。结合液体处理和微量滴定板先进的传感的全自动微生物反应器平台，或缩小的生物反应器培养也可以使用82，83。结合新兴的测量异质环境中代谢网络活性和代谢过程的方法（方框2），将获得丰富的信息以促进学习。

方框1 |设计-构建-测试-学习循环，以创建具有所需功能的合成微生物组

我们提出了一个通用的设计-构建-测试-学习循环，用于创建具有所需功能的合成微生物组，集成了自上而下和自下而上的方法。我们简要描述了循环的两次迭代，并确定了综合采用高通量方法和自动化来提高速度和再现性的机会。

自上而下的方法

设计：识别生物过程。利用或复制过程的一个例子是将复杂的木质纤维素生物质厌氧转化为有价值的商品化学品。初始设计步骤包括选择可能含有具有所需功能的微生物（例如，酸相厌氧消化污泥、草食性瘤胃微生物组或其他微生物）的不同接种物。包括环境参数（pH、温度、养分等）和预期功能团体（水解菌、发酵菌、产甲烷菌等）的概念生态系统模型用来选择富集变量。

构建：从多种来源富集微生物组。来源接种物在不同的环境条件下，利用真实的（如木质纤维素水解液或瘤胃液）和合成介质培养，以选择所需的功能。通过对环境条件和介质组成的调节，达到了预期的功能。对于复杂环境（如土壤），实验室生态系统模型可能是微生物富集的理想平台146。

测试：评估性能。利用高通量表型筛选，对真实和合成培养基上富集微生物的性能进行测试。利用微流控或自动微反应器实验可以开发出高通量筛选。更深层的多组学测量（如宏基因组学、宏转录组学和宏蛋白质组学）是从高性能微生物组中收集的。

学习：确定微生物组成员的关键功能角色。除了关键功能外，通过代谢重建和多组学分析还确定了所需功能的瓶颈。这种理解有助于完善微生物组功能的概念模型，并创建定量模型。

自下而上的方法

设计：识别新的潜在微生物伙伴。模拟代谢模型用于筛选相互作用微生物的高效微生物组富集物。组装的宏基因组基因可用于重建关键微生物组成员的代谢模型。自动化的计算工作流（加上人工管理）将加速模型的建立。流量平衡分析用于预测每个微生物对最佳生长和活性的需求，并将单个代谢模型统一到微生物组模型中，以确定新的潜在合作伙伴，从而改进设计目标（例如，更高的滴定度、速率或有价值产品的产量）。

构建：将关键微生物重组成新的合成菌群。在分离或富集之后，在不同比例（例如，1:1，1:10）模拟预测的基础上，关键微生物组装成新的合成菌群。微流控设备和/或液体处理机器人可用于高通量分离和重组。

测试：测试菌群的功能和稳定性。高通量表型筛选结合多组学测量可用于检测。这一步骤还应包括验证预测的单个分离物或富集物代谢。

学习：识别控制功能的微生物相互作用。用代谢通量分析在菌群内生长的微生物与在分离中生长的微生物的代谢，可以确定重要的机制和相互作用。这一认识可用于提出如何通过环境操作和/或原位基因组工程优化微生物组的功能和稳定性。

微生物组代谢网络活性（Microbiome metabolic network activity）

为了在系统水平上测试微生物组的功能预测，测量微生物组的原位代谢网络结构和活性至关重要。多组学方法（宏基因组学、宏转录组学、宏蛋白质组学和代谢组学）与生物信息学工具相结合，使得能够以基因组为中心分析微生物组内的单个物种（甚至菌株）115，并对序列、蛋白质和代谢物s116–118进行全局测量。这些工具在光谱上测量微生物组分，从功能潜能（例如基因丰度）到表达产物（例如蛋白质和代谢物丰度），并通过其组合活性产生驱动系统功能的微生物组宏表型。目前，用于推断微生物组功能的多组学方法主要集中在将跨时空的基因丰度或基因表达数据与生态系统地球化学数据或过程速率相关联。这包括使用定量PCR分析（例如氨单加氧酶）119、微阵列（例如，GeoChip）120或非靶向高通量方法（宏转录组和/或宏蛋白质组）测量关键功能基因和转录。虽然有助于整个系统表征和发现，这些方法侧重于测量系统的组成部分或“部件列表”，或系统的“零件清单”，由于代谢网络的复杂性、相互作用和调节，通常会限制潜在表型的预测因子。因此，需要新的方法和工具来测量微生物组代谢网络的原位化学计量和流量，以便对设计预测进行直接测试，并为代谢调节提供机制见解。代谢通量分析是测量体内通量最权威的方法。该方法利用代谢网络模型123计算同位素标记实验期间获得的代谢物稳定同位素测量的通量。尽管代谢通量分析已被用于测量共培养中的通量124，但由于代谢产物池不易分配给单个细胞，并且微生物组中可能的反应数量大大超过单个生物体，因此在群落中的通量分析具有挑战性。然而，同位素示踪剂结合外代谢组学和/或尾气分析已被用于驱动重要微生物组功能的确定过程通量，例如厌氧消化116中的共营养的醋酸氧化与甲烷生成。为了规避代谢产物测量的挑战，提出了一种用短肽代替氨基酸进行代谢通量分析的标记模式分析方法。利用高通量的宏蛋白质组学方法，肽可以被分配到微生物组中的单个物种，这为确定微生物群落中的通量（即“宏通量组学”）打开了大门。鉴于通量代表了细胞在所有水平上调节的最终结果126，进一步发展和展示宏通量组学对于推进微生物组工程工作和我们理解微生物组的代谢调节至关重要。这也将需要新的软件包来进行相关的计算分析，类似于现有的13C代谢通量分析软件127。这样的数据还可以让代谢建模者推断，而不是假设，群落水平和单菌水平的目标函数，并确定新的约束条件，允许准确预测和测量驱动微生物组功能的反应速率。

图3 |构建自组装和合成微生物组。a |从多种微生物来源组装合成微生物组的流程。利用自动微流控细胞分选技术，可以将复杂的微生物组分离成关键的功能成员。然后，分离或富集的成员可以使用液体处理机器人重组为合成菌群，用于下游筛选和/或培养。b |微生物组的组装也可以通过生物反应器操作或生物刺激（上）的环境选择来实现，或者通过使用定义的培养物（底部）的生物强化来实现。c |另一种选择是通过微生物组的定向适应和/或进化来获得或优化所需功能的微生物组组装。d |原位微生物组工程可用于为环境中的土著微生物组添加新功能。

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空间异质环境中的功能测量（Measuring function in spatially heterogeneous environments）

大多数自然微生物组，例如与植物（例如根际）、人类（例如口腔微生物群）和工业过程（例如酸性矿井排水）相关的微生物组，在直接影响微生物组功能的微观物理化学梯度上显示出高度组织化的空间组成。例如，微生物的空间接近性可以控制它们是否通过扩散底物或直接转移相互作用128，而菌落大小的变化可以显著地影响生物膜微生物的表观底物亲和常数和底物竞争129。因此，最大的挑战之一将是创造工具，在所有相关尺度（从微米到千米）上测量和报告微生物组的空间结构和功能。目前，利用荧光原位杂交结合稳定同位素标记130、化学指纹131、质谱图132和/或基于荧光的生物正交非标准氨基酸标记133等方法测量结构-功能关系主要集中在微米到毫米尺度上（方框2）。尽管这些技术已经成功地确定了微生物组中空间分布微生物的底物利用和活性模式，但它们受到通量的限制，只能检测和/或区分有限数量的物种。标记技术（例如稳定同位素标记和生物正交非标准氨基酸标记）与宏蛋白质组学和细胞分选（例如荧光活化细胞分选）133的综合应用可用于高通量和空间分辨率的微生物代谢活性测量。结合描述微环境化学特性的微传感器装置（例如，通过微电极134或工程生物传感器95），可以实时监测微生物组结构、微生物组功能和生态系统理化参数。

学习微生物组设计原则（Learning microbiome design principles）

在微生物组工程的设计、建造和测试阶段取得进展，为我们提供了一个从以往的失败和成功中吸取教训，并将新知识融入后续循环的独特机会。事实上，DBTL循环的学习阶段对于成功和提高微生物工程效率至关重要。到目前为止，还没有一种通用的策略、技术或方法能够保证成功地将从测试阶段获得的信息转化为新的知识，从而为下一个设计阶段提供信息。因此，我们强调在早期将足够的重视和资源投入到学习阶段的重要性，以避免例如由于在学习步骤中相对缺乏投资而在代谢工程中遇到的困难13。

需要进一步发展计算方法，使学习阶段形式化，包括机器学习算法48135136、代谢通量分析和基于约束的分析36124125137、生态系统建模方法138和调控网络分析139。总之，这些分析可以从大数据集中分离出微生物组相互作用和功能的主要驱动因素，从而为微生物组的设计提供信息。例如，广义Lotka-Volterra方程可以从作为自下而上设计起点的时间种群动力学数据中推断相互作用物种140或基于约束的分析可以应用于从13C代谢数据中识别关键的代谢物交换反应，从而提高通量模拟的准确度并改进厌氧菌群137。

更广泛地说，我们认为学习阶段的重点是通过不断完善概念知识和提出的理论（例如，从传统的宏观生态学）51，141-144（每个DBTL循环），将数据转化为微生物组工程的一般原理。我们建议利用实验室生态系统模型来推动微生物组工程的研究和学习。模型实验室生态系统是一个实验平台，可以以简化和控制的方式复制复杂环境（自然环境或工程环境）的物理化学条件，并包含模型微生物组（例如，模型根际微生物组（THOR）145可作为学习如何设计、构建和优化工程微生物组的测试依据。这些生态系统减少了复杂性，可以用于实验，并且可以以可重复的方式建立，当人们在自然环境中工作时，这往往是不可能的。

最近，实验室生态系统模型已经开发出来，用于研究植物-土壤微生物组的相互作用146。这些人工构建的生态系统利用三维打印、传感、分析和图像技术，创造了一个复制原生土壤生态系统的实验装置，在该装置中，可以根据变化的变量监测微生物和宿主表型，允许系统地分析影响植物健康的微生物相互作用和代谢物交换146，147。人工生态系统在模式生物和复杂的自然微生物之间提供了一个中间地带，并且可以在专家研究人员之间协作建立，以创建标准化和可复制的设备和协议，传播到更广泛的研究群体。这样的模型系统能够以一种容易处理的方式实验性地开发出具有所需功能的工程微生物组，并允许将结果与自然环境下的结果进行比较。这种模型与自然生态系统之间的交叉研究将是一种有价值和必要的方法，有助于学习与实际系统（而非实验室手工艺品）相关的工程原理和实践，并有助于获取有关将基于实验室的工程策略扩展到全面应用的知识（图5）。例如，以微流体为基础的人体肠道微生物组的体外模型，包含了与不同细菌群共培养的人体细胞，已经产生了生理（包括上皮细胞单层形成、细胞生长和活力、细胞因子水平和代谢谱）和环境（包括氧梯度和层流）可与体内变量148相比较的变量。

将生态系统模型与DBTL循环结合起来，对于理解控制微生物相互作用和功能稳定性的机制可能特别有成效。大量的知识可在特定的微生物上进行共聚集和交换代谢物，如涉及氮循环的细菌、甲烷氧化古菌的联合体和硫酸盐还原菌128149150，以及与氢营养的甲烷菌151152合作的同营养细菌。然而，我们才刚刚开始了解调节群落中微生物行为、相互作用和亲缘关系识别的复杂机制（如群体感应和次级代谢产物153）。虽然研究已经建立了微生物组功能冗余、多样性和稳定性之间的联系154，但尚未建立一个预测或设计功能稳定微生物组的框架。通过使用模型实验室生态系统与现有的微生物生态学和工程设计知识，有可能破译微生态系统的化学语言，并发现其他重要的过程（包括进化、选择、分散限制和中性过程）的机制155，这些机制使得鲁棒性和稳定的微生物组功能。将这一理论转化为工程设计实践需要一个量化的框架，将这些机制与代谢相互作用网络和新的方法联系起来，使代谢模型产生生态特性（框注3）。

图4 |测试微生物组功能。a |同位素示踪剂结合宏蛋白质组可以通过分析短肽而不是氨基酸（代谢组）的同位素标记模式来测量微生物组的代谢通量。b |生物正交非标准氨基酸标记是一种利用荧光检测或蛋白质组学快速分析原位合成代谢过程（生长）的方法。c |整合宏基因组学、宏转录组学、宏蛋白质组学和代谢组学，可以重建和分析微生物组的代谢网络表达。d |一个自动化的微生物反应器平台允许在不同条件下（例如，随着环境或生理变量的变化）对微生物组过程进行高通量分析。该平台可以集成工具，对微生物组单个成员和复杂群落进行详细的功能分析。过程监测图中的绿色、红色和黄色与微生物反应器孔的位置相对应。HPG，高丙炔甘氨酸；MS，质谱。

方框2 |测量微生物组功能的工具箱

多组学集成

从宏基因组数据28组装基因组的能力使得能够在不同群落内对单个转录组63和蛋白质组118进行基因组注释分析，并大大提高了多组学数据集的注释能力。向前迈进的一个关键挑战将是整合代谢组学信息163，包括细胞内和细胞外，这些信息不能轻易地分配给微生物组的单个成员，如DNA、RNA和蛋白质。大量未知的或特征性差的基因、酶和代谢物目前限制了多组学信息的注释能力。然而，它确实为进一步的生化研究创造了新的靶点。生物信息工具的进展，例如数据驱动方法（例如，统计或机器学习方法）和基于知识的方法（例如，交互网络或基因组规模的代谢模型）164，165，将是通过连贯的多组学数据集成系统测量微生物功能成功的关键。

同位素示踪剂

同位素示踪剂在纯培养物和群落功能分析中有着悠久的历史，并且已经与DNA166、RNA167和蛋白116测量相结合，将个体种群与特定的原位功能联系起来。展望未来，需要更多的努力将同位素示踪技术与多组学（特别是宏蛋白质组学和代谢组学）结合起来，以阐明微生物组内复杂的代谢网络。这些技术的结合还应为测量细胞内和细胞外反应速率（“宏流量组学”）124125铺平道路，124125是在工程化纯培养物中阐明体内表型、途径限制和代谢调节的最有力工具之一。

质谱成像

质谱成像（MSI）技术显示了复杂样品中元素及其同位素以及生物分子的分布。MSI非常适合于分析空间结构的微生物组和研究细胞间的相互作用。当与荧光原位杂交结合时，MSI还允许将微生物组结构与功能168169连接起来。用不同的MSI技术可以获得的化学覆盖率、空间分辨率和样品制备取决于使用的电离方法132。尽管纳米二次离子质谱（nanoSIMS）与基质辅助激光解吸电离（MALDI）或解吸电喷雾电离（DESI）相比具有更高的横向分辨率，但其相对化学通用性非常低（元素和同位素与肽、脂类、代谢物和其他分子相比）。因此，nanoSIMS通常被用于研究单个细胞的底物使用，而MALDI–MSI则被用于可视化群体之间的化学相互作用132。尽管MALDI–MSI和DESI-MSI比nanoSIMS170更易接近，并且能够很好地显示微生物体内广泛的化学相互作用，但它们的通量非常低，其横向分辨率和灵敏度目前无法进行单细胞代谢分析132。结合这两种方法的最佳技术是纳米结构引发剂质谱（NIMS）。NIMS是一种无基质解吸/电离技术，它依赖于被困在30nm孔中的引发剂分子来实现吸附在孔表面的小分子的电离。NIMS具有约150nm的横向分辨率，特别适合于肽和代谢物171的分析。到目前为止，NIMS在微生物172，173中的应用还很有限。我们预计，解决这些问题的进展将很快使MSI成为一个有用的、应用更广泛的微生物功能组分析工具174。

生物正交化学

代谢标记技术，如生物正交非典型氨基酸标记（BONCAT），提供了额外的方法来测量微生物组原位合成代谢活性。BONCAT基于非标准氨基酸（例如，l-叠氮高丙氨酸，l-蛋氨酸替代物）的体内翻译结合，然后通过叠氮-炔键合化学175对标记的细胞蛋白质进行荧光标记。该技术可与核糖体RNA靶向荧光原位杂交技术相结合，直接将分类学与原位活性175联系起来。BONCAT还与荧光活化细胞分选相结合，从复杂样品中分离出活性细胞，并通过DNA序列133进一步对其进行表征。此外，标记的蛋白质可以通过小珠捕获选择性地富集并进行蛋白质组分析176。这些方法的联合应用可以在不同的理化条件下对未培养微生物合成的蛋白质进行高通量示踪。虽然BOCAT由于细胞氨基酸摄取和代谢紊乱的差异而受到限制，但该技术为在单细胞水平上的原位活性的相对简单、廉价和高通量分析提供了灵活的工具。

微流体

能够在单细胞分辨率下对微生物进行高通量分析的设备对于微生物的快速培养和功能分析非常重要。微加工设备，如微流控“芯片上的实验室”技术，可以提供多种应用，包括从复杂的微生物组中分离单个细胞和种群177，建立体外细胞模型，促进合成微生物组的组装和在异质微环境条件下的实验178，以及用于快速监测和检测所需表型的在线诊断。这些应用仍处于开发的早期阶段，仍然存在一些挑战，包括可靠地检测液滴中的微生物、精确控制气体浓度、交叉污染和技术可获得性177179。

自动化

为了提高微生物组工程的重现性、生产量、效率和标准化，自动化的进步是必要的。这包括将液体处理机器人、微流控设备、自动化培养系统、在线物理化学测量传感器和软件纳入数据生成和分析工作流程。新出现的例子包括使用液体处理机器人与用于高通量培养的自动化微发酵平台82，或使用微流体技术自动分析数千个探测微生物群落相互作用的液滴实验114，180。这种自动化平台还可以集成一些功能工具（例如，单细胞分析和多组学），从而产生丰富的可重复数据集，可用于机器学习和其他大数据分析。

图5 |微生物组工程基本原理的学习。实验室生态系统模型可用于具有简化微生物组和环境特性的控制实验，代表介于纯实验室条件（如试管或烧瓶）和复杂自然环境（如土壤或海洋）之间的系统。需要在实验室规模的模型和自然复杂生态系统之间进行持续的交叉检验，以制定既在实际系统中可靠又在实验室中易于处理的工程原理和实践。这将需要多个利益相关者之间的密切合作，包括研究人员和最终用户（如医院或处理厂），他们在每个规模的具体问题上都有专业知识和经验（a部分）。为使系统化微生物组工程成为可能，需要学习的关键原则包括微生物相互作用机制（b部分）、控制功能稳定性和退化性的机制（c部分）以及定量绘制和模拟复杂生态系统生态位的框架（d部分）。MS，质谱；SIP，稳定同位素标记。

方框3 |微生物组工程的新兴原理：生态位建模的案例

生态位建模可用于系统地设计高阶特性，如工程微生物组的功能稳定性和鲁棒性。然而，要开发这样一个框架，就需要理解微生物组中保持多样性的机制，以及多样性如何赋予诸如功能稳定等特性。在这里，我们提出这种理解可应用设计-构建-测试-学习循环来回答关键问题：

功能退化是否会导致生产力和功能稳定性？

多样性与大型生物群落的生产力和功能稳定性相关，但多样性在改善微生物组功能和功能稳定性方面的作用仍然是开放的。对于微生物组工程，我们建议通过功能冗余（如前154所述）或更具体地说，功能简并来看待、讨论和定义多样性。这是一组物种在生态系统功能（例如，甲烷氧化、固氮或聚合物水解）中发挥相同作用的程度，但表现出相对于其他生理特征（例如，pH优化或生物膜形成）的简并性。这使得它们能够实现现实生态空间并共存。设计-建造-测试-学习循环期提供了一个极好的机会来理解功能简并的分子基础，并检查如何通过量化基本的和现实的生态位空间来预测出现的群落级特性，如抗干扰能力或对其他物种入侵的敏感性微生物组。我们认为生态位模型可以成为实现这一目标的一个特别有用的框架。

微生物生态系统如何保持多样性？

为了建立一个生态位模型框架，了解如何保持多样性将是很重要的。竞争排斥表明，在相同的生态位中144，两个具有相同资源需求的物种不能共存。因此，我们需要了解创造位空间和允许多样性发展和保持的机制。例如，时空变异、休眠、捕食、营养负荷、次生代谢产物产生和抗性、细胞运动和生物膜形成等过程在生态位分化中有什么作用？如何操作这些过程，以达到并保持微生物组中所需的功能简并水平？对这些问题的回答将提供微生物组工程机制，以设计和控制生态位空间以获得所需的微生物组特性。

生态位模型是如何作为微生物组工程的基础的？

为了使系统工程具有理想的高阶微生物组特性，我们提出微生物组工程为生态位建模开发了一个框架。该框架的目标是通过整合多组学数据、生理信息、养分有效性和环境参数，量化群落和个体的基本生态位和现实生态位空间，并利用它们制定控制微生物组合作和竞争的策略。为了实现这一目标，需要定义一个物种或团体的基本生态位和现实生态位的新数学表示，以及描述环境变量响应的适应度函数。当纳入微生物组模型时，该框架将允许对高阶特性进行生态预测，并量化合作和竞争的微生物组全貌。此外，这些框架将有助于指导尚未解决的重要微生物组设计问题，例如功能冗余和最小多样性之间的权衡。

展望

微生物组工程的真正进展将需要多个DBTL回合来捕获必要的生态学原理，以精确的方式操纵微生物组，并获得可预测的结果（图1）。例如，将在以前的DBTL循环中发现的物种间电子转移直接纳入代谢模型和生物反应器结构（例如，通过添加导电材料）可以优化废物的沼气生产效率27，或者设计工程大肠杆菌来控制先前发现的自我诱导物的水平，可以在生物失调的条件下使肠道微生物组朝着更健康的方向发展156。然而，开发快速周转的新知识和工具将需要下一代基础设施，用于数据收集、数据共享和知识集成。为了加快进度，开发学习阶段所需的预测能力是一个优先事项。实验室生态系统模型结合自动化技术的进步，如液体处理机器人、微流体和数据分析管道157，158，将为以严格和可重复的方式测试多种设计提供一个起点。从这一过程中获取新知识，并将信息整合到随后的DBTL循环中，将加速微生物组工程的发展，创造新颖的生物技术和实践，用于医学、农业、制造业和环境中微生物组的管理。

在这些领域推进微生物工程的例子包括阐明噬菌体与代谢产物交叉喂养在控制瘤胃碳代谢中的作用159，利用未开发的厌氧真菌-细菌联合体提高生物量转化为有价值的生物制品160,161，创造微流控细胞分选技术，从高多样性的样品中自动分选稳定同位素标记的细胞，用于随后的多组学分析或培养162，开发原位宏基因组工程工具，将新功能引入原生环境中的微生物111。为了推进DBTL方法，具有实验（例如，培养、分子遗传学或生物化学）、计算（例如，代谢建模、机器学习或生物信息学）、自动化（例如，机器人学或微流体学）和实践（例如，专业工程师或医生）等专业知识的跨学科研究团队是必不可少的。鉴于我们对微生物生态学的初步理解，微生物组工程的未来之路似乎很漫长；然而，围绕DBTL循环构建研究和技术开发为推进微生物组工程和提供解决紧迫社会和环境问题的创新解决方案提供了一个有希望的途径。