原文链接：https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC8699867/

As an ecofriendly biocontrol agent, antagonistic bacteria are a crucial class of highly efficient fungicides in the field against Verticillium dahliae, the most virulent pathogen for cotton and other crops. Toward identifying urgently needed bacterial candidates, we screened bacteria isolated from the cotton rhizosphere soil for antagonisitic activity against V. dahliae in an artificially infested nursery. In preliminary tests of antagonistic candidates to characterize the mechanism of action of on culture medium, 88 strains that mainly belonged to Bacillus strongly inhibited the colony diameter of V. dahliae, with inhibiting efficacy up to 50% in 9 strains. Among the most-effective bacterial strains, Bacillus sp. ABLF-18, and ABLF-50 and Paenibacillus sp. ABLF-90 significantly reduced the disease index and fungal biomass of cotton to 40–70% that of the control. In further tests to elucidate the biocontrol mechanism (s), the strains secreted extracellular enzymes cellulase, glucanase, and protease, which can degrade the mycelium, and antimicrobial lipopeptides such as surfactin and iturin homologues. The expression of PAL, MAPK and PR10, genes related to disease resistance, was also elicited in cotton plants. Our results clearly show that three candidate bacterial strains can enhance cotton defense responses against V. dahliae; the secretion of fungal cell-wall-degrading enzymes, synthesis of nonribosomal antimicrobial peptides and induction of systemic resistance shows that the strains have great potential as biocontrol fungicides.

Keywords: extracellular enzyme, nonribosomal peptides, cotton, resistant gene expression, biocontrol fungicides

摘要

拮抗菌是一种环境友好的生物防治剂，是田间对抗棉花和其他作物最致命的病原菌大丽轮枝菌的一类重要的高效杀菌剂。为了确定急需的细菌候选物，我们在人工感染的苗圃中从棉花根际土壤中分离出细菌，以检测其对大丽轮枝菌的拮抗活性。在初步测试拮抗剂候选物对培养基的作用机制时，88 株主要属于芽孢杆菌的菌株对大丽轮枝菌的菌落直径有很强的抑制作用，其中 9 株的抑制效果高达 50%。在最有效的细菌菌株中，芽孢杆菌属 ABLF-18 和 ABLF-50 以及类芽孢杆菌属。 ABLF-90 显著降低了棉花的病害指数和真菌生物量，使其达到对照的 40-70%。在进一步的试验中，为了阐明生物防治机制，菌株分泌了胞外酶纤维素酶、葡聚糖酶和蛋白酶，这些酶可以降解菌丝体，以及抗菌脂肽，如表面活性素和伊枯草菌素同源物。与抗病性相关的基因 PAL、MAPK 和 PR10 也在棉花植株中表达。我们的研究结果清楚地表明，三种候选细菌菌株可以增强棉花对 V. dahliae 的防御反应；真菌细胞壁降解酶的分泌、非核糖体抗菌肽的合成和系统抗性的诱导表明这些菌株作为生物防治杀菌剂具有巨大的潜力。

关键词：胞外酶、非核糖体肽、棉花、抗性基因表达、生物防治杀菌剂

图1 拮抗大丽轮枝菌候选细菌的系统发育分析。通过 ClustalW 比对 16S rRNA 序列，并使用 MEGA 软件（版本 7.0，美国宾夕法尼亚州费城天普大学）通过邻接法构建系统发育树，进行 500 次引导。

图2 最好的9种细菌对大丽轮枝菌的拮抗效果评估。（a）拮抗情况。（b）菌落直径。（c）抑制效果。根据 Duncan 检验，不同字母表示处理间存在显著差异（p < 0.05）。

图3 潜在的生物防治效果(a). 棉花幼苗表型分析。用无菌蒸馏水和候选细菌溶液接种 24 小时后，用 V991 分生孢子悬浮液接种棉花幼苗，并在 14 dpi 进行处理。(b). 疾病指数分析。(c). 真菌生物量检测。棉花小亚基核糖体 RNA 基因 (SSU) 用作内源性对照，而 Verticillium 核糖体 RNA 基因的 ITS1 和 ITS2 区域 (Z29511) 被选为量化 V. dahliae 的定殖。误差线表示来自三个独立实验的标准偏差，不同的字母表示使用 Duncan 检验确定的 p < 0.05 处的显著差异。

图4 胞外酶活性分析。在不同培养基上测试了蛋白酶活性（a）、葡聚糖酶活性（b）和纤维素酶活性（c）。不同字母表示 Duncan 检验中 p < 0.05 处存在显著差异。

图5 芽孢杆菌 ABLF-18、芽孢杆菌属ABLF-50 和类芽孢杆菌属ABLF-90 的 MALDI-ToF MS 光谱。

图6 棉花抗性基因的表达模式。通过 qRT-PCR 检查 PAL、MAPK 和 PR10 的表达水平。在接种后 24 小时从感染 V. dahliae 的棉花根中提取 RNA。误差线代表来自三个独立实验的标准偏差，不同的字母表示使用 Duncan 检验确定的 p < 0.05 处的显著差异。