碱基错配和碱基选择

   1953年，詹姆斯·沃森和弗朗西斯·克里克发表了他们的DNA双螺旋结构模型后，生物学家最初推测，大多数复制错误是由所谓的互变异构位移引起的。DNA中的嘌呤和嘧啶碱基以不同的化学形式或称互变异构体存在，其中质子在分子中占据不同的位置（图1a）。沃森-克里克模型要求核苷酸碱基以更常见的“酮”式参与碱基配对。事实上，一个核苷酸里的碱基也可以“亚氨基”或“烯醇”互变异构体形式参与碱基配对，那就可能影响 DNA 分子的构象，导致碱基对不再符合Watson-Crick配对要求（图1b)，故成了“错配”(图1C)。这就使“碱基选择”（base selection)变的必要。

   所谓“碱基选择”，是由碱基配对类型所能形成的氢键数和碱基沿DNA 模板时彼此的“堆积”（Stacking)有关的热力学稳定，以及所呈现的碱基对是否能适应DNA聚合酶在“聚合模式”（polymerization mode)下的空间构象所决定的。

图1a 互变异构体

图1b Watson-Crick 碱基对(B型双螺旋所需）

图1c Hoogsteen 碱基对（与非B型构象有关）

碱基选择和修复DNA复制中的错误

尽管DNA半保留复制中存在的碱基选择可以有效促进“Watson-Crick pairing”，即A与T，C与G彼此形成氢键。但碱基选择依然保有10-4～10-5的突变率。相当于每10万（100,000）个核苷酸中约1个发生配对错误（10-5的出错率)。这样的出错率对于一个物种而言是“无法容忍”的。比如，人类二倍体细胞中有62亿个碱基对，10-4～10-5的突变率相当于每次细胞分裂后含有大约12万个碱基配对错误！

   所幸的是，细胞已经进化出高度复杂的方法来修复大多数（但不是全部）错误。在复制过程中，一些错误会通过一个“3’-5’外切酶校对的过程立即得到纠正（DNA聚合酶的proof-reading mode），而另一些错误会在复制后通过一个名为“错配对修复”（Mismatch repair)进一步修复得到纠正。

  具体过程如下：

    当一个不正确的核苷酸被添加到生长链（Growing Point）时，由于核苷酸暴露的3′-OH基团处于“错误”的位置(影响DNA的构象。在复制过程中，新的核苷酸通过其5′-磷酸基团与链上前一个核苷酸的3′-OH基团结合而添加到生长链中。)，复制会暂时停下来，由聚合模式（Polymerization Mode）转为proof-reading Mode。通过3‘-5’外切酶切除错误插入的核苷酸，以便复制可以继续。这种校对最高可进一步修复99%配对类型的错误，但这对于正常的细胞功能来说仍然不够。

  复制后，错配对修复进一步降低了最终错误率。不正确配对的核苷酸会导致最终DNA分子二级结构的构象受到影响。在错配对修复过程中，酶通过去除错误配对的核苷酸并用正确的核苷酸替换来识别和修复这些影响DNA构象的错配对。

复制错误变成突变I

错配对修复后仍然存在的错误配对的核苷酸在下一次细胞分裂后将被“固定”成为永久性突变（Permeant mutation）。这是因为一旦接受了这些错误配对，细胞就不再将其识别为错误。考虑碱基互变异构体（Wobbling(摆动）, 类似于不同的  tRNA反义密码子编码同一种氨基酸的情形）。一旦这种配对引起的复制错误没有得到纠正，那之后的DNA链将成为未来复制过程的模板，导致此后的所有碱基配对都是错误的。

例如，原始链有一个C-G对；然后，在复制过程中，由于“摇摆/摆动”，胞嘧啶（C）可与腺嘌呤（A）配对。在这种情形下，“摆动”是因为A有一个额外的氢原子。而在下一轮细胞分裂中，带有C-A配对的双链将在复制过程中分离，每条链都作为合成新DNA分子的模板。在C和A的位置，C会与G配对，形成与原始序列相同的双螺旋（即在摆动发生之前的双链DNA），但A会与T配对，形成一个新的DNA分子，用A-T配对代替原始的C-G配对对。这种类型的突变被称为碱基“转换突变(Transition)。即一种嘌呤替换为另一种嘌呤或一种嘧啶替换为另一种嘧啶的碱基替换；如果嘌呤被嘧啶取代，或嘧啶被飘零替换，则称为“颠换”(Transversion)。

  此外，当DNA 复制一些重复序列或能够形成hairpin (发卡，又称茎环结构)、loop(环）等等非B型DNA 二级结构时，DNA 聚合酶会因“停止-重开始”进行“链滑移”复制（DNA slippage replication)。

  一般而言，这类二级结构不能被3’-5’外切酶校对，有些也不能被碱基错配对机制加以修复（通常在附近有错配对时，被碱基错配对修复顺带修复）。一旦这类错误没有得到纠正，它们就会变成插入和缺失突变(Insertion and deletion mutation: I/D mutation)。

俄勒冈大学的George Streisinger在20世纪70年代进行了大量关于DNA slippage replication 引发的基因突变的早期研究。他利用大肠杆菌病毒T4噬菌体证明，大多数核苷酸插入和缺失突变发生在含有重复DNA 序列（也称为正向串联重复序列， Tandem repeats ）的DNA区域，于是他提出了链滑移假说来解释原因。

比如，DNA模板链上的含有一串单核苷酸重复T，当发生滑移时，附近重复碱基的存在稳定了滑移，从而可以进行复制。在下一轮复制过程中，当两条链分离时，模板链或与之互补的新合成的DNA 链上的插入或缺失将分别作为永久突变而存在。现在，Streisinger的链滑移假说已经得到确认。

与DNA 复制有关的基因组本底突变率

人类基因组单倍体(n)约有3.2×109 bp(32亿碱基)，双倍体，2n则含有64亿碱基。经过“碱基选择”，DNA 聚合酶3’-5’外切酶校对，以及复制后碱基错配对修复等过程，人基因组中每个碱基对的突变率，较一致的看法是突变率约为10 -8突变/bp/复制一次。

因此，单倍体基因组复制一次得到的突变体为：10- 8 x 3.2×10 9碱基对（ bp/基因组／复制），约为10~100个突变/复制一次。而对于2n基因组而言，每复制一次的突变碱基数至少在20～200碱基对范围。

如果让这个细胞扩增100次，变成2 99 +1个细胞（不算致死突变），那么依据理论计算，单个碱基对／复制的突变率，所有细胞突变体数应该为100×（20～200）=2000～20000个突变。这个突变数除以2 99个细胞，则为所得细胞群体平均每个细胞的单个碱基对突变个数。

低突变率也会造成麻烦

不同人群之间，甚至个体基因组内的不同区域之间，突变率差异很大。现有的报告表明，即使突变率低至每1亿（10 -8）至10亿（10 -9）个核苷酸出现1个核苷酸错误也可能造成会引发严重问题的突变体。以细菌为例，突变率可以高达1／100～1／1000（每100（10 -2）至1000（10 -3）个核苷酸一个错误。在人类一组易出错的聚合酶基因中，即使突变率低至10 -10次方，也会随着时间的推移迅速积累突变体。特别是在细菌等快速繁殖的生物体中，本底突变就会成为抗生素耐药性的公共卫生问题的原因之一。只凭DNA 复制的本底突变，细菌群体就可以积累充足的遗传变异，以适应（响应）抗菌药物施加的自然选择压力。以大肠杆菌为例。这种常见肠道细菌的基因组约有4.6x10 6bp。约为460万个碱基对，即920万个碱基。如果以突变率10 -9（即介于估计值10 -8和10 -10之间）计算，每次大肠杆菌分裂时，每个子细胞平均将有0.0092个新突变。或者，另一种思考方式是这样的：大约1%的细菌细胞将含有新的突变。这似乎并不多。然而，由于细菌的分裂速度可达每小时两次，因此单个细菌可以在大约10小时内生长成100万个细胞的菌落（220=1048576）。这意味着约10,000个细菌将积累至少一种突变。

随着携带不同突变的细菌数量的增加，其中至少一种细菌产生耐药性表型的可能性也在增加。同样，在真核生物中，细胞在分裂时会积累突变。比如在人类中，如果在一个人的一生中积累了足够多的体细胞突变（即体细胞而不是性细胞，如精子或卵细胞的突变），最终结果可能是癌症。或者，不太常见的是，一些癌症突变是从父母一方或双方遗传的，这些通常被称为种系突变。最早的癌症相关体细胞突变之一是在1982年发现的，当时研究人员发现突变的H-Ras基因与膀胱癌症有关。H-Ras编码一种有助于调节细胞分裂的蛋白质。从那时起，至今已经确定了数百个“癌症基因”。其中一些基因，如与遗传性非息肉病性癌症（HNPCC）相关的少数种系突变，在DNA修复中起着至关重要的作用。

当然，并不是所有的突变都是“坏的”。但是，由于如此多的突变会导致癌症，DNA修复显然是真核细胞至关重要的。尽管太多的突变可能是危险的，但如果DNA修复是完美的，没有突变积累，就不会有遗传变异——这种变异是进化的原材料。因此，成功的生物体已经进化出有效但不足够有效地修复DNA的方法，以提供足够的遗传变异性来继续进化。