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在细菌全基因组测序数据分析中，区域(regional)和功能注释已经成为常规操作。一个完整的基因组注释是下游分析的基础，而注释的准确性和全面性往往影响研究结果。

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最近来自德国一个生物信息学团队们开发了Bakta，一款新的命令行工具，用于自动化和标准化的细菌基因组注释。该文章最近在《MICROBIAL GENOMICS》公开发表。

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作者认为现有的各种注释软件工具都在以下问题留下了改进的空间：

1. 尽管早在20年前就发现了以前被忽视的保守的短ORF(sORF)，但它们既不能预测也不能检测到短于29个氨基酸的小蛋白的编码序列(CDS)，因为在基因预测工具中实施了基因长度截断，以减少错误的从头预测的数量。

2. 它们不识别存储在公共数据库(如RefSeq和UniRef100)中的已知蛋白质序列，因此不能分配数据库交叉引用(dbxref)，即稳定的公共数据库标识符，方便与更详细的数据库互连。

3. 对于跨越人工序列边的CDS结构注释，没有考虑附加的序列信息，即完整性和拓扑结构。

为了解决这些问题，团队们开发了Bakta。它为编码和非编码基因提供了全面的注释工作流程，并加之CRISPR阵列、gaps、oriC和oriT特征的预测。与其他轻量级注释管道不同，Bakta能够通过自定义的sORF提取和过滤步骤来检测和注释小分子蛋白。而CDS注释流程通过一种基于哈希的、无需比对的蛋白质序列识别方法。

注：CRISPR，clustered regularly interspaced short palindromic repeats

此外，这种新的方法便于通过稳定的标识符交叉引用公共数据库来标注CDS。

方 法

软件工作流程如下图。

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输入文件为fasta格式的基因组组装序列。

可选择输入序列元数据文件或Prodigal软件提供的training文件。非编码基因，比如tRNA使用tRNAscan-SE预测和注释。

gaps、oriC和oriT等特征的预测用BLAST+工具。利用Prodigal预测CDS，使用BioPython提取短于30个氨基酸的小蛋白的sORF。

HMMER和AntiFam分别过滤假阳性序列和重复的sORF。为了加快对CDS和sORF的注释，使用无比对序列鉴定（AFSI），即通过全长蛋白序列MD5哈希算法和相关蛋白质序列长度检查进行鉴定的组合过程。使用Diamond和UniRef90比对识别剩余的未识别蛋白质序列。

Bakta有自建的SQLite数据库，用于识别查找UniRef100, UniRef90、UniRef50、RefSeq、COG、EC 、GO、耐药基因、VFDB等。对于还是没有明确注释的CDS标记为假设蛋白（Hypotheticals），通过HMMER使用Pfam HMM图谱筛选蛋白质结构域。

性能评估

通过与其它软件工具进行基准测试，评估Bakta的性能。

首先是注释得到的特征结果之间的比较。作者选择E. coli O26 : H11 strain 11368菌株的基因组，分别使用Prokka、DFAST、PGAP与Bakta比较，如下表。对于CDS，PGAP和Bakta预测到更多的基因。在CDS序列的功能注释方面，PGAP和Bakta表现最好，且Bakta是唯一一个分配到GO术语的工具。

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其次是功能注释的性能基准测试。选择来自RefSeq的35个不同分类的细菌基因组进行注释。统计其假设蛋白占总CDS的比例，如小提琴图。

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同时统计了在没有用AFSI（Bakta w/o AFSI，只是用Diamond比对序列）和使用AFSI的假设蛋白占总CDS的比例，两者之间的差异只有0.9%。

由此得出，AFSI对RefSeq中检测到的小蛋白的功能注释贡献很小。表格中展示了Bakta检测到的小蛋白参与的一系列与致病性高度相关的重要过程，以及更一般的细胞内务管理过程。

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最后比较了Bakta的运行时间、内存消耗和存储需求。在具有4个Intel Xeon E5-4627CPU和总共40个核的服务器机器上，使用不同数量的CPU连续三次测量注释E.coli O26：H11 strain11368的PROKKA、DFAST、Bakta和不使用AFSI的Bakta的运行时间。

结果如下图和表格。Bakta虽然运行时间时最慢的，但它所包含的数据库内容是最多的，其分析深度也有很大提高。对比没有使用AFSI的Bakta，在同等条件下，使用AFSI大大提高了序列注释的速度。

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其它优势

Bakta可以对宏基因组的MAG进行注释，在与DFAST和Prokka的比较中，Bakta依旧是假设蛋白占总CDS比例最低的；注释结果格式符合INSDC标准；在线版Bakta应用程序，提供交互式GUI向导，可输入数据与命令行工具一样，适合不太熟悉命令行操作的研究员，地址：bakta-web-ui (computational.bio)

结 语

通过以上的工作流程介绍和性能评估，该软件有如下优势：

1  Bakta在已知和未知物种的分类范围内对CDS序列的功能注释方面优于现有工具

2  Bakta能够检测和注释当代预测工具无法预测的小蛋白，比如在使用Prodigal和MetaGeneAnnotator工具预测时

3  Bakta能够精确识别已知的蛋白质序列，并分配RefSeq和UniProt数据库标识符

4  新的AFSI方法加速了Bakta的功能注释工作流程

5  Bakta利用序列元数据改进了CDS的结构预测

6  Bakta以功能类别(COG、EC和GO)为CDS提供了同等或更全面的注释。

目前看来，较为明显的缺点就是运行时间长，虽然提供了Web版本，但如果样本数量较大，还是需要在linux上运行。

参考文献：

Schwengers O, Jelonek L, Dieckmann MA, Beyvers S, Blom J, Goesmann A. Bakta: rapid and standardized annotation of bacterial genomes via alignment-free sequence identification. Microb Genom. 2021 Nov;7(11). doi: 10.1099/mgen.0.000685. PMID: 34739369.

本文转自：谷禾健康