文章已发表在SCI期刊 Journal of Integrative Plant Biology（生物学1区Top ，IF 9.3），评论可以沾沾好运~标题为：The VvPUB8–VvbHLH93–VvMYB15/VvMYB5a module inhibits the synthesis of anthocyanins in grape in response to MeJA

花青素是影响葡萄品质的关键因素。在不同浓度下，茉莉酸甲酯对葡萄花青素含量表现出浓度依赖性效应，但其分子机制尚不清楚。本研究鉴定了一个响应茉莉酸甲酯的E3泛素连接酶VvPUB8，并通过在“佳美”葡萄愈伤组织中过表达和突变体载体转化，验证了该基因负向调控葡萄花青素合成的功能。

进一步研究发现，VvPUB8与转录因子VvbHLH93直接互作，而VvbHLH93可通过激活VvMYB15和VvMYB5a启动子正向调控花青素合成。蛋白质的稳定性或活性受泛素化修饰类型和数量的调控。

本研究表明VvPUB8通过催化VvbHLH93发生K6和K33连接的泛素化修饰，进而促进其降解。外源茉莉酸甲酯处理加速了VvbHLH93蛋白降解并抑制VvMYB15启动子活性，最终导致葡萄花青素合成受阻。

本研究揭示了在茉莉酸甲酯响应过程中，VvPUB8通过差异性多聚泛素链修饰调控VvbHLH93稳定性，进而调节VvMYB15和VvMYB5a启动子活性，最终抑制花青素合成的分子机制。

图1. 茉莉酸甲酯诱导VvPUB8抑制葡萄花青素合成。

（A）不同浓度茉莉酸甲酯（0、0.1、1.0和10 mM）处理“赤霞珠”葡萄果实的表型分析。比例尺=5 cm。

（B）MeJA处理后“赤霞珠”葡萄果实花青素含量测定。

（C）EL31–EL36时期葡萄果实内源MeJA含量。

（D）不同浓度MeJA对VvPUB8基因表达水平的影响。MeJA处理6 h后采集样品，立即用液氮冷冻进行RT-qPCR分析。

（E）VvPUB8过表达“佳美”愈伤组织的花青素含量及提取液颜色。

（F）VvPUB8敲除“佳美”愈伤组织的花青素含量及提取液颜色。

（G）VvPUB8过表达“佳美”愈伤组织的表型观察及提取液颜色。

（H）VvPUB8敲除“佳美”愈伤组织的表型观察及提取液颜色。OE#1、OE#4和OE#6为三个过表达VvPUB8的株系；KO#2、KO#3和KO#4为三个CRISPR/Cas9敲除VvPUB8的株系。pRI101-AN-GFP和CRISPR/Cas9空载体作为对照。

数据为平均值±标准差；n=3个生物学重复。不同字母表示经单因素方差分析（Tukey检验）差异显著（P < 0.05）。

星号表示与空载体对照相比有显著差异（*P < 0.05，**P < 0.01，双尾Student t检验）。

图2. VvPUB8与VvbHLH93在体内和体外的互作验证。

（A）酵母双杂交试验。共转化pGBD-p53与pGAD−T7及pGBD-p53与pGAD+T7作为阳性对照，共转化pGBD-VvPUB8+pGAD及pGBD+pGAD-VvbHLH93作为阴性对照。将共转化pGBD-VvPUB8+pGAD-VvbHLH93的酵母细胞培养于添加20 mg mL⁻¹ X-α-Gal的营养缺陷型培养基（SD/−Trp−Leu−His−Ade）上。

（B）Pull-down试验。将纯化的重组蛋白VvPUB8-GST和GST分别与VvbHLH93-MBP蛋白孵育，并用谷胱甘肽琼脂糖珠固定。使用抗GST和抗MBP抗体检测蛋白。

（C）双分子荧光互补试验。将pSPYNE-VvPUB8与pSPYCE-VvbHLH93瞬时共转化本氏烟叶片。以pSPYNE与pSPYCE-VvbHLH93共转化及pSPYNE-VvPUB8与pSPYCE共转化作为阴性对照，通过共聚焦显微镜观察黄色荧光蛋白信号。比例尺=25 μm。

（D）荧光素酶互补成像试验。将VvPUB8-nLUC与VvbHLH93-cLUC在本氏烟叶片中瞬时共表达，以VvPUB8-nLUC与cLUC共转化及VvbHLH93-cLUC与nLUC共转化作为阴性对照。使用植物体内分子标记成像系统观察荧光信号。

（E）免疫共沉淀试验显示VvPUB8与VvbHLH93在体内的互作。

图4. VvPUB8在体外对VvbHLH93进行泛素化修饰。

（A、B）VvPUB8具有E3泛素连接酶活性，可在体外对VvbHLH93进行泛素化修饰。将纯化的原核蛋白VvPUB8-GST和VvbHLH93-MBP与E1、E2及Ub在泛素化反应缓冲液中于37°C孵育2小时。

反应结束后，在（A）中使用抗GST、抗MBP和抗Ubi抗体检测蛋白质的泛素化水平。在（B）中使用ImageJ软件对抗Ubi抗体的Western blot检测结果进行定量分析，计算相对泛素化水平。以VvPUB8-GST蛋白水平设为1.0。星号表示与对照组相比差异显著（**P < 0.01，双尾Student t检验）。

（C–F）同样，在体外泛素化反应缓冲液中添加不同类型泛素（UbK6、UbK27、UbK33、UbK48R、UbK63R、UbK11和UbK29），以鉴定VvPUB8对VvbHLH93进行泛素化修饰的泛素链类型。独立重复三次实验，结果相似。

使用ImageJ软件对抗Ubi抗体的Western blot检测结果进行定量分析。以VvbHLH93-MBP蛋白水平设为1.0。不同字母表示经单因素方差分析（Tukey检验）差异显著（P < 0.05）。

图8. VvPUB8响应MeJA调控VvbHLH93抑制葡萄花青素合成的分子模型。

在低浓度MeJA条件下，VvbHLH93通过激活转录因子VvMYB15和VvMYB5a启动子活性，正向调控葡萄花青素合成。当存在高浓度MeJA时，VvPUB8表达显著诱导；VvPUB8通过K6和K33两种泛素链对VvbHLH93进行泛素化修饰，加速VvbHLH93蛋白降解，并抑制VvbHLH93对VvMYB15转录因子启动子的激活作用，从而阻断葡萄花青素合成。

总之，我们提出了一个模型，阐明VvPUB8–VvbHLH93–VvMYB15/VvMYB5a模块通过MeJA信号通路调控葡萄花青素合成（图8）。在正常条件下，VvbHLH93通过激活VvMYB15和VvMYB5a启动子正向调控花青素合成。当存在高浓度MeJA时，VvPUB8被显著诱导表达。随后，VvPUB8通过两种泛素链类型（K6和K33）对VvbHLH93进行泛素化修饰，加速VvbHLH93降解，并抑制其对VvMYB15启动子的激活作用。该过程最终抑制了葡萄花青素的合成。

本研究揭示了E3泛素连接酶VvPUB8与转录因子VvbHLH93响应MeJA处理抑制葡萄花青素合成的分子机制，为MeJA激素调控葡萄花青素合成提供了新视角。

本研究得到国家自然科学基金、生物育种与农产品精深加工专项、科技人才与平台计划以及国家葡萄产业技术体系的资助。感谢LetPub（www.letpub.com.cn）在论文准备过程中提供的语言协助。

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