“坐而论道，不如起而行之”。做好真学问，需要不厌其烦地与同行进行深度交流与合作。遇到新现象，能够敏锐地意识到其潜在的科学意义或工程价值，并且寻找到其答案，这是具有挑战性的。“众里寻她千百度,慕然回首,那人却在灯火阑珊处”，这也是科研最大的乐趣。

【摘要】 可降解镁合金植入高血糖和糖尿病患者体内面临挑战。我们提出葡萄糖能够加速镁合金体外细菌活动和降解速率的假设。通过16S rRNA高通量测序技术和微生物分离培养技术，我们分离和鉴定出了Hank’s溶液中的细菌，对照了有无葡萄糖的Hank’s溶液，发现葡萄糖显著加速了Mg-Li-Ca合金的细菌入侵、降解和力学性能的劣化。

    近年来，随着人口老龄化趋势的逐步加深，人们越来越关注公众健康。特别是高血糖和糖尿病等疾病在年长者中具有普发性。这与肥胖、不良的饮食习惯和身体的惰性密切相关，并且可能会引起一系列的其他健康问题：骨质疏松症、心脏病、中风、神经病变、肾脏疾病和糖尿病足等。值得注意的是，糖尿病足与高含量葡萄糖和细菌感染之间密切相关。因此，在国际人口老龄化大趋势下，生物医用材料的需求也是日益增加，这也就意味着那些患有高血糖和糖尿病的患者在植入环境下将面临着巨大挑战。

    生物医用材料包括：金属、高分子、陶瓷和其复合物。其中，惰性金属，像不锈钢和钛合金由于其良好的力学性能和耐蚀性能，在临床领域已经得到广泛应用。然而，镁及其合金由于其生物可降解性，与骨相近的弹性模量，并能够特异性地促进人成骨细胞的分化和生长，已成为下一代可降解金属基植入体，并在近年来开始在临床上应用。

    在前期工作中，我们研究了葡萄糖对纯镁及镁合金Mg-Ca、Mg-Li-Ca、AZ31降解行为的影响。研究表明：在模拟体液Hank's溶液中，纯镁的降解速率随着葡萄糖浓度的增加而降低。这主要是由于葡萄糖转化为葡萄糖酸，而葡萄糖酸能够螯合溶液中的Ca²⁺离子。因此，在样品表面形成了Ca-P膜层，进而一定程度低阻止了腐蚀性离子的入侵。并且，葡萄糖浓度越高，溶液的pH值更低。

    另一方面，在临床植入实验中，细菌感染是外科和外伤性伤口处理中的重要风险，特别是在开放性骨折固定和关节翻修手术中。无论其来源或位置如何，都会大大增加发病率和死亡率。前期植入手术的失败常常和几种特定的细菌有关。最常见的几种细菌主要有：链球菌、厌氧革兰氏阳性球菌和厌氧革兰氏阴性杆菌。因此，研究细菌导致的植入体的腐蚀/降解有着重大的意义。

    在每年的春夏之交，敞开体系的析氢腐蚀试验似乎总会有一位神秘的不速之客造访实验室，导致Hank’s溶液pH值出现反常现象。2012年一位研究生首次发现Mg-Ca合金在Hank’s溶液中出现弱酸化现象，pH降低到7以下，似乎与葡萄糖有关。2014年我们揭示了葡萄糖醛基酸化成羧基的机理，研究结果于2015年发表在Scientific Reports （doi: 10.1038/srep13026)。

    2013年，另一位研究生观察到溶液出现更为严重的酸化问题，通过扫描电子显微镜观察到镁合金样品表面杆状细菌形貌，能谱分析含有N和S，这表明蛋白质和氨基酸等有机成分的存在。

    这些微生物或细菌究竟从哪里来？如何增殖？哪种细菌引起了溶液酸化？环境、地域因素有影响吗？同行有没有类似问题？这些有关微生物腐蚀的跨界问题一直未能搞清楚，让我们心神不宁，也感觉力所不及，也迫使我们寻找合作伙伴。

    2015年6月16日我发邮寄给郑玉峰教授，询问他的课题组是否发现过类似现象。第二天他有三个学生回复。一位学生注意到偶尔也有pH值从7.4降低0.1-0.3的时候，但没有酸化。“我当初猜测的原因可能是模拟液中二氧化碳含量的变化导致的。关于染菌的情况，我们以前做都是在正常环境中做的，模拟液也没有灭菌处理，整个浸泡过程也都是处在有菌环境中做的。而且细菌在（pH）五点多的环境中应该也长不好。”另一位学生观察到挤压态镁合金在Hank’s溶液中，部分出现酸化，pH降到6.5。第三位学生指出，“浸泡过程中浸泡液里如果有絮状物，或者溶液颜色发黄了，存在细菌的可能性就很大，不过我们一般没有表征，有这样的情况就重做了”。

    这些反馈意见提示，揭开此神秘来客的面纱是很有必要和紧迫的。对于指导镁合金体外降解试验将具有重要的价值。或许我们真的不能忽视微生物的存在及其潜在影响。

    在2015年8月厦门大学第二届海峡两岸功能材料科技与产业峰会上，遇到台湾口腔生物科技暨医疗器材产业发展促进协会赖辰雄理事长，在会议间隙与他有过交流。后来出差到北京，顺道到北京大学，向郑玉峰教授介绍这项研究的进展。郑教授提出了很好的问题和建议。我也专门写信给中科院上海硅酸盐所的刘宣勇研究员，征求他对项工作的建议。在2015、2018年青岛的两次会议上，分别遇到两位擅长微生物腐蚀研究的年轻学者，中国科学院海洋研究所段继周研究员和东北大学徐大可教授，真正开始了这次合作研究之旅。特别是徐大可教授团队分离出菌落和产酸菌，特别给力。后来，偶然见到美国来访的顾教授，给我们的论文修改提出了有益的建议。借此机会，感谢上述教授们和同学们对我们工作的帮助！

    基于此，山东科技大学曾荣昌教授团队、东北大学徐大可教授团队和中国科学院海洋研究所段继周研究员团队联合对“葡萄糖对Mg-Li-Ca合金的体外细菌活动和降解行为”进行了系统的研究，通过16S rRNA基因检测技术和微生物分离培养技术，成功地分离和鉴定出了Hank’s溶液中的细菌群落；同时和不含葡萄糖的Hank’s溶液进行了对比，探讨了两种产酸菌对Mg-Li-Ca合金溶液pH值及降解速率的影响；并进一步考察了细菌生长周期及其对力学性能的影响和提出解决此问题的策略。

    本研究表明，将Mg-Li-Ca合金浸泡在Hank’s溶液中，溶液的pH值降低到5.0左右（图1a）。如此低的pH值与样品表面附着的细菌活动密切相关。浸泡24 h，样品表面已经可以看到杆状细菌的附着；当继续浸泡到48 h时，样品表面已经被一层致密的细菌包围形成膜层（图1c）。而不含葡萄糖的Hank’s溶液中，直到浸泡到168 h之后，才在样品表面检测到少量的N元素，这表明葡萄糖显著促进了细菌的活动。另一方面，由于葡萄糖促进的细菌活动还明显地加速了力学性能的劣化。

图1 Mg-Li-Ca合金浸泡在Hank’s溶液中析氢速率图（a）和不同时间段的SEM形貌图：（b）24 h, (c) 48 h, (d) 96 h 和（e）168 h。

   通过16S rRNA方法和富集分离培养方法，我们分离得到了浸泡后可培养的细菌单菌落（图2）。在这其中，有两种产酸菌：微杆菌和香坊肠杆菌。并进一步探讨了这两种产酸菌分别会对Mg-Li-Ca合金降解行为产生的影响。研究表明：香坊肠杆菌的产酸效率比微杆菌高，在浸泡初期含香坊肠杆菌的溶液pH值低于含微杆菌的Hank′s溶液，其腐蚀速率也大于含微杆菌的Hank′s溶液。细菌的存在都加速了镁基体的腐蚀。

    最后，我们又针对这种酸化现象进行了解决办法的尝试。在溶液中加入硫酸庆大霉素以及定期更换溶液来减少微生物对腐蚀的影响。结果表明，在Hank′s溶液中，添加抗生素并定期更换溶液可以有效地避免微生物活动的影响，减少酸性物质的产生，进而降低了Mg-Li-Ca合金在Hank′s溶液中的腐蚀速率。

    本研究发现了在浸泡实验中微生物入侵导致溶液pH值呈现酸性的现象。作为体外测试腐蚀速率的基础性步骤，析氢测试这一反常的实验现象应引起我们科研工作者足够的注意。葡萄糖作为细菌活动的主要碳源，提供了细菌活动所需的能量。经过我们的研究表明，在浸泡大约48 h 后，细菌增殖达到顶峰，在样品表面产生较为致密的生物被膜。随着时间延长，镁腐蚀碱化，导致pH值回升，细菌出现凋亡。细菌活动显著地加速了Mg-Li-Ca合金在Hank′s溶液中的降解速率，并降低了其塑性。

    进一步通过16S rRNA基因测试方法，确定了分离出的两种产酸菌：微杆菌和香坊肠杆菌。其中微杆菌的增殖对降解速率的影响更大。最后，我们又尝试使用在溶液中加入硫酸庆大霉素以及定期更换溶液来减少微生物对腐蚀的影响。本研究加深了我们有关微生物入侵对于Mg-Li-Ca合金体外降解影响行为的认识，并扩宽了体外降解评价体系的知识。镁合金Hank's溶液中细菌的来源及抑制细菌活性的系统方法值得我们追踪和进行更为深入的研究。

图2 Hank’s溶液中提取出的细菌相关性示意图

       该研究得到了国家自然科学基金(51571134)和山东科技大学校级科研创新团队经费(2014TDJH104)的支持。第一、二作者为山东科技大学硕士研究生李令玉和韩壮壮。原文信息：Ling-Yu Li, Zhuang-Zhuang Hana, Rong-Chang Zeng∗, Wei-Chen Qi, Xiao-Fan Zhai, Yi Yang, Yun-Tian Lou, Tingyue Gu, Dake Xu∗, Ji-Zhou Duan,∗Microbial ingress and in vitro degradation enhanced by glucose on bioabsorbable Mg–Li–Ca alloy. Bioact Mater. 5(2020) 902-916. doi: 10.1016/j.bioactmat.2020.06.014.