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韩春雨 NgAgo 无 PAM 优势或被证明

已有 8246 次阅读 2016-11-15 11:12 |系统分类:科普集锦

在《韩春雨 NgAgo 精确定位功能被验证-- 剑未出鞘剑气逼人》一文中,我对最近南通大学、复旦大学若干分子生物学家对韩氏 NgAgo 用于斑马鱼的结果进行了总结,认为该研究确认了 NgAgo + gDNA 的基因定位功能。

今天我在回应吴炬博士的猜想时,又查看了该通讯的补充数据,突然发现这个研究还证实了 NgAgo 相对 CRISPR-Cas9 的另一个优势,那就是 NgAgo 不需要 PAM 就能定位。缩写字玄乎,读者如果不知道什么是PAM,可以查阅我之前的科普 《CRISPR 基因编辑技术及张锋的贡献》。简单的说,在 CRISPR-Cas9 系统中,Cas9 不能在随意的地点开始进行匹配,必须 Cas9 先匹配上几个字符,然后才能匹配目标字符串。这几个字符取决于 Cas9 蛋白的类型。以常用的 SpCas9 为例,其PAM为 NGG. 其中N表示任意字符。因此如果用 SpCas9 ,可以定位的基因点只能在 NGG 这样的字符串旁边。否则,即使 gRNA 跟基因某处字符串全部对上,但旁边的字符串不是 NGG,系统就不工作了。我们可以说,Cas9 蛋白有个固有的限制。这就某种程度上影响了 CRISPR-Cas9 系统的灵活性。
而韩春雨的 NgAgo 系统没有这个PAM 的限制。对正方向DNA链,CRISPR-Cas9 只能打PAM 上游(5'端)的目标,NgAgo 是指哪打哪。
那么南通大学这个研究是否证实了这一点呢?我们看看数据。研究中对斑马鱼眼睛基因的目标打击的 CRISPR-Cas9 系统如下:
nt1.jpg
注意看, gRNA1 是在CGG前, gRNA2 是在 AGG前 (forward 5' to 3')。这是 SpCas9 的PAM限制的结果。当然了,从上面看GG出现很多,所以PAM的限制也不是那么严重。
再看文中 NgAgo 的 gDNA:
nt3.jpg
nt2.jpg
根据上图,使用 NgAgo , 导引 gDNA 可以连续滑动延展,看不出有任何限制。
NgAgo + gDNA 的精确定位功能,我再引用文章中的数据说明一下。针对 斑马鱼的尾巴,下面这个导引可以

5’-CGAGTACATTGCATTAGGGTCGAG-3’

但这个就不行了:
5’-CGAGTACATAACATTAATTTCGAG-3’

两者前面9个字符(CGAGTACAT)与后面5个五个字符(TCGAG) 相同,中间的CATTA 也相同。


韩春雨事件
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