yuedongxiao的个人博客分享 http://blog.sciencenet.cn/u/yuedongxiao

博文

CRISPR 基因编辑技术及张锋的贡献 精选

已有 14429 次阅读 2016-9-17 08:33 |个人分类:生物|系统分类:科普集锦

地球上所有细胞生物的遗传信息都储存在数字化的DNA序列中。今天,基因测序技术已经非常发达,DNA序列可以非常廉价迅速的确定。但测序只是读取数据,近年生物学最大的发现与发明之一是可编程的基因编辑技术:CRISPR-Cas9。这个技术类似于 WORD的搜索替换功能:用户输入一串字符串,程序找到匹配的字符串,然后进行删除或者替换。CRISPR-Cas9 的编辑技术里,搜索匹配字符串由实验人员通过一段 RNA表示,叫做导引 RNA -- gRNA,编辑由一个称为 Cas9 的蛋白根据 gRNA 定位完成。这个编辑系统的灵活性显而易见。Cas9 蛋白是固定的,你只需要改变导引就能在不同位置对DNA进行编辑 (注一)。


CRISPR-Cas9 技术的来源是细菌的自然免疫系统。某些细菌在遭到病毒入侵后,能够把病毒基因的一小段存储到自身的 DNA 里一个称为 CRISPR 的存储空间。当再次遇到病毒入侵时,细菌能够根据存写的片段识别病毒,将病毒的DNA切断而使之失效。有的细菌的CRISPR系统很复杂,涉及多种 Cas 蛋白 (Cas 的意思是 CRISPR-associated -- 与CRISPR相联的 )。经过多年的研究,生物学家们终于找到了一种简单的系统,只用到一种蛋白 -- Cas9。接下来,他们成功把这个细菌的系统进行改造用于动植物细胞的基因编辑。率先完成这一实际应用性开发的是张锋的研究小组。本文试图对相关技术与历史进行简单的介绍。

这里我把CRISPR之前漫长的研究历史一笔带过。简单而言,人们之前发现细菌免疫系统依靠一段很短的RNA进行识别,这段RNA称为 crRNA (CRISPR  RNA)。可想而知,这段 crRNA 包含有入侵病毒的基因识别码。

CRISPR相关研究在2011年取得了重大突破。这一年,法国女科学家 Emmanuelle Charpentier 报告,通过基因分析与相关实验,发现一个只有四个组件的细菌免疫系统。除了 Csn1 蛋白(后来称为 Cas9)与 crRNA外,还发现一个他们称之为 trans-activating CRISPR RNA(简称 tracrRNA)的RNA。顾名思义,这个 tracrRNA 起到转写-启动的功能。第四个组件是一个作用于RNA的生成,称为 RNase III的蛋白。但这篇2011年的论文对各个组件的具体功能并没有完全确定。其论文中的下图显示 :蓝色是 Cas9 蛋白,红色的是 tracrRNA, 绿色+黑色线段是 crRNA (其中绿色部分对应需要识别的病毒编码),黄色是RNase III。

2011-deltecheva.jpg


Charpentier 的论文发表后,美国加州大学的 DOUDNA (“道得娜”---有些中文文章音译成“多德娜”属于错误读音)与她的研究小组隔洋合作,进行了进一步研究,于2012年6月发表了一篇重要论文。相关研究人员与主要结果如下图:

jinek-paper-authors.jpg


DOUDNA、Charpentier 联合小组通过在细胞体外的试管实验发现了负责DNA切割的充分并且必要的三个部分:Cas9, crRNA 与tracrRNA (不需要 RNase III)。论文还确定了三个部分的作用:其中Cas9 是切割机, crRNA 的主要作用是定位。而 tracrRNA 在与crRNA耦合后启动 Cas9 的切割功能(activate)。他们还成功把 crRNA 与tracrRNA 连起来成为一个分子,这样可以把 DNA 切割的组件由三个变成两个。如上图。左边是自然原核细菌中的机制,两个RNA分子。右边则是人工机制,把两个RNA给连起来了,成为一个带着一个配对圈的RNA分子。但 DOUDNA 等人的实验并没有在任何细胞内进行,只是在细胞体外的试管里,当然也没有在动植物等真核细胞内实验,也不知道能否可行( “it was not known whether such a bacterial system [the CRISPR-Cas9 system] would function in eukaryotic cells.”) 。在该论文发表后几个月 DOUDNA等人表示在真核细胞的实验中遇到了很多困扰("many frustrations")。

现在我们知道,Charpentier 2011年的论文出来后,美国东部 BROAD研究院的张锋小组也展开了研究。在Doudna/Charpentier 2012年6月论文发表前半年,张锋在2012年1月向NIH申请了一个项目:运用Cas9系统对真核细胞进行基因编辑。张锋的项目设计如下(从其项目申请截图):

zhang-2012-01-nih2.jpg

上图是一个哺乳动物 CRISPR 基因编辑系统的设计。其代码进行表达后会生成四个部分:(1)带NLS的Cas9 蛋白,(2)tracrRNA , (3)多个 crRNA -- 注意不同颜色的线段 (图中称为 guide RNA array),(4) 带NLS的RNase III。真核细胞的特点是遗传物质在细胞核内,一般较大的蛋白是进不去的。其中 的 NLS 是为了使 Cas9 等 生成后能够被拖入细胞核内。可以这么说,张锋的思路是先不管具体机制是什么,直接在高等生物上进行基因编辑实验,而且多点编辑同时进行。


张锋小组的核心人物包括:张锋、丛乐、FEI RAN
feng_zhang.pngle_cong.pngfei_ran.png


张的小组在2013年1月发表论文,报告了他们的发现:(1)他们对四个组件进行了组合实验,发现基因编辑不需要 RNase III;(2)使用 Cas9 、crRNA 与 tracrRNA 组合,成功对真核细胞实现编辑,效率相当高( indel 达19%);(3)使用 DOUDNA 论文中的嵌合 RNA (chimera),发现长的那个(chimera A )编辑效率较双RNA系统低 (最高5.6%, 部分无法探测),短的那个 (chimera B) 不能编辑(注二)。如下图:

zhang-main-result.jpg

结论:

张锋首次将 CRISPR-Cas9 成功用于高等生物的基因编辑,其主要成果是基于2011年 Charpentier 的 tracrRNA  发现(注三)。



注一:Cas9 的工作机制是先找到 DNA上的一个特定的称为 PAM的序列,然后才是导引与DNA链的结合以及切割。所以,可行的DNA切割点不是任意的。PAM是一个限制。不同细菌的Cas9 蛋白的PAM序列不同,有的长些,有的只有三个字符,所以要找到可行的切割点也不是难事。

注二:后来的研究发现 组合 chimera RNA 加长后效率更高。

注三:张锋后来又发现一个 系统-- CRISPR/Cpf1,蛋白比 Cas9 小,只需要crRNA(不需要 tracrRNA), 切割位置离PAM远。



http://blog.sciencenet.cn/blog-684007-1003348.html

上一篇:英语听力测试答案揭晓
下一篇:CRISPR基因编辑技术的显然性分析

25 许培扬 蒋德明 蔡小宁 孙学军 王小林 李颖业 王汀 刘建栋 黄永义 陈智文 徐令予 李红莉 王大岗 陈冬生 薛宇 李红雨 吴炬 王恪铭 zhouwangpu shenlu apple79 yunmu tuner sciencewatch crossing

该博文允许注册用户评论 请点击登录 评论 (51 个评论)

数据加载中...

Archiver|手机版|科学网 ( 京ICP备14006957 )

GMT+8, 2019-8-22 17:01

Powered by ScienceNet.cn

Copyright © 2007- 中国科学报社

返回顶部