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使用Image J进行自动荧光定量分析

已有 139756 次阅读 2013-10-3 03:59 |个人分类:活色生香de生物科学|系统分类:科研笔记| image, 荧光定量分析

在这里我整理我最近使用ImageJ软件自动数细胞以及定量分析荧光强度的步骤.

ImageJ的主面板:

打开文件

File → Open →’.zvi’

先把2D的所有图叠加起来,选项选max intensity

Image →stacks → 3D project


复制一张图:

Image →duplicate

调整Thereshold,实际上是选择想要纳入计算的细胞的区域,选定的区域会用红色高亮标记:

Image →Adjust → Threshold


如果觉得背景太强可减去背景:

Process → Subtractbackground

当红色高亮标的斑块就是想要的细胞时,点击Apply

Image →Adjust → Threshold→ apply


有些细胞叠加,可用watershed自动划为两块斑块.

Process → Binary → watershed

设定参数,在这里redirected to...不能选择已经标记的这张图,实际上这张已经被转换为二进制图,只有黑和白二色,要选择adjust thereshold之前的那张,这就是为什么3D Z-stack之后要多复制出一张图.

Analyze→ Set measurements (Redirected to… greyscale image)


然后点击

Analyze → Analyze particles


我的细胞大小大概是5μm,我手动画了个圈面积大概是250pixel^2,所以这里我选

size是250-infinity.因为我只感兴趣荧光平均值,如果要定量细胞大小,可能要选250-350,否则

有些叠在一起的细胞会被当做一个细胞来计算

Size(pixel^2)=250

Soma size=5 μm ^2

5μm=31.25 pixel

5 μm ^2=244pixle^2250pixel^2

show里面选择outline也很好,可以自动圈出细胞

Show: outlines→ OK


过几秒钟,这个图就出来了同时还有result 和summary,是excel表格,可以保存.

然后就可以得到图片中细胞数量,荧光强度平均值,最大最小值等等数据.看这张圈圈图,还是很帅的,呵呵.这些步骤还是很烦的,小水獭刚弄的时候几次想放弃,步骤太多,前后次序不能乱,小水獭表示为什么不能更加简便一些,不就是画圈圈么,汗//b不过处理了50张图以后,小水獭表示短期内还是能记住这些步骤的,于是在博客里保留一个中文使用说明,以助他日之用.


主要参考的是第一篇文献(我会告诉你我基本是翻译第一篇文献么,╭(╯^╰)╮哼~~~),第二篇给了很好的调整的提示.

等我写完了之后,我想,以前别人也肯定会遇到同样问题啊?!然后google了一下(Image J 荧光),科学网,小木虫都有的:

http://bbs.sciencenet.cn/thread-210524-1-1.html这篇步骤特别清楚.

早知道就google中文的了,google(Image J, fluorescence quantification)只找到英文步骤,其实挺难搞懂的.

参考文献:

http://www.unige.ch/medecine/bioimaging/tricks/imagejtutorials/Quantification.pdf

http://sciencetechblog.com/2011/05/24/measuring-cell-fluorescence-using-imagej/





https://blog.sciencenet.cn/blog-5525-729670.html

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IP: 121.249.15.*   | 赞 +1 [17]高志国   2017-12-26 19:33
博主我想问一下,细胞的两种颜色叠加的图怎么画一条线得到一条线上荧光强度的所有数据,然后用origin作图看出荧光峰值重合或不重合的样子呢
回复  我不会这个,我建议你google
2018-1-17 02:031 楼(回复楼主) 赞 +1 |
IP: 222.66.117.*   | 赞 +1 [16]Dorothy9   2017-8-29 12:43
很感谢您四年前的这篇分享,对我这样一个刚开始做实验的新手帮助很大,您的步骤非常详细,免去了自己去摸索的时间和精力。

但我在实际操作中仍遇到一些问题。您在文中介绍:



设定参数,在这里redirected to...不能选择已经标记的这张图,实际上这张已经被转换为二进制图,只有黑和白二色,要选择adjust thereshold之前的那张,这就是为什么3D Z-stack之后要多复制出一张图.



Analyze→ Set measurements (Redirected to… greyscale image)



然后点击



Analyze → Analyze particles



以上这些操作都是对adjust threshold之前的图片进行操作吗?我在操作时软件提示需要对adjust threshold之后图片进行操作,然后我就对后者操作,结果得到的mean gray value都是同样的,即使是不同图片都是得到的同一个荧光强度,对于这一点我就有点不是很理解,不知道是不是自己在哪一步操作出现问题。



如果方便的话很希望能加您qq请教,万分感谢!
IP: 222.35.62.*   | 赞 +1 [15]吴炬   2016-12-2 16:40
用于拍照片的荧光显微镜一般不是自带了图像处理软件吗?您用到的这个定量分析不算事儿啊。ImageJ应该不能用于两种以上荧光的定量分析(我只用它分析过电泳条带灰度,所以不知道是不是可以),但显微镜自带的软件可以。
回复  我们的显微镜没带
而且imageJ免费啊
2016-12-9 03:381 楼(回复楼主) 赞 +1 |
IP: 221.0.92.*   | 赞 +1 [14]lichengchenglc   2016-12-2 15:20
为了评论,我现注册了个账号,虽然我有的地方不明白,但文章是真心不错,欣赏分享的学者,给32个赞
IP: 36.248.73.*   | 赞 +1 [13]zzz1989   2016-2-23 18:44
“打开文件
File → Open →’.zvi’
先把2D的所有图叠加起来,选项选max intensity
Image →stacks → 3D project”
在这里面的“先把2D的所有图叠加起来,选项选max intensity”没明白是什么意思,可以劳烦博主解释一下下吗?非常感谢
IP: 58.58.52.*   | 赞 +1 [12]clerk0126   2016-1-15 16:38
还有一个问题楼主,我直接把图片变成8-bit图片,这样检测出来的平均值是什么的?能直接用这个吗
回复  应该都可以,最好你先选一块均匀区域,看通过我的方法得出来的结果,和你手动得出的结果是不是一致。
2016-1-15 23:381 楼(回复楼主) 赞 +1 |
IP: 58.58.52.*   | 赞 +1 [11]clerk0126   2016-1-15 16:23
你好,楼主,最近在用这个软件看到本微博,首先着实表示感谢,在感谢之余,还遇到好多问题,第一:在Analyze → Analyze particles 这一步如果是两张图片同时点开的话直接提示不能进行下一步;第二,“,要选择adjust thereshold之前的那张,这就是为什么3D Z-stack之后要多复制出一张图.”我的这张本来就不是3D图片,但是显微镜里面出来的照片,是普通的TIF格式的照片,这样的话该怎么弄?麻烦楼主一定帮着解决一下这个问题,拜托了
IP: 171.122.15.*   | 赞 +1 [10]rmd06   2015-11-20 15:29
哦  我弄错了,是黑白位图链接到原图进行选区。抱歉,忽略上一条吧。
IP: 171.122.15.*   | 赞 +1 [9]rmd06   2015-11-20 15:27
感觉这里面有个错误,不知道是否如此:
用了threshold后,把具体的灰度信息都丢失了,而是简单分裂为0和1,这样计算的结果是不准确的吧?
IP: 202.127.20.*   | 赞 +1 [8]唐宇   2014-6-15 09:41
IP: 89.253.103.*   | 赞 +1 [7]徐媛   2013-12-14 05:35
不错,学习!
IP: 123.139.37.*   | 赞 +1 [6]FJJF   2013-10-22 10:56
世上无难事只怕有心人 赞!
回复     你最近很忙吧?
2013-10-22 23:051 楼(回复楼主) 赞 +1 |
IP: 128.163.8.*   | 赞 +1 [5]唐凌峰   2013-10-4 05:48
很实用的博文,我收藏了,你不会删除吧?
回复     肯定不会删除啦,我本来是为了给自己留个备份,以后电脑上找不到了,网络上还有一份.
2013-10-5 00:201 楼(回复楼主) 赞 +1 |
IP: 132.183.13.*   | 赞 +1 [4]马欢   2013-10-3 22:12
不一定需要java,不太复杂的任务ImageJ的macro应该就能搞定。
IP: 130.237.35.*   | 赞 +1 [3]徐磊   2013-10-3 15:15
Image J 这个工具是不错,也一直在发展,但是如果想更好的利用它,需要使用java 语句来编写批处理的程序。我没学过 java语句, 相同的问题我可能会尝试用matlab来解决。不过如果对matlab生疏的话,还是需要学习....anyway,如果对于你的研究,这样处理就可以满足需要的话,也没有必要折腾了就是。
回复     我是电脑盲 Java....metalab...还是算了
2013-10-3 22:581 楼(回复楼主) 赞 +1 |
IP: 213.103.216.*   | 赞 +1 [2]徐磊   2013-10-3 13:42
你这样还得手动,而且设定threshold本身就是个麻烦,不同的照片都需要单独设定,照片量一大就没法弄了。
回复  可是我目前看到的其他方法,是自己画圈圈,而且还画的不一定契合细胞外缘.我这样一次设定可以同时画上500个圈圈.
2013-10-3 14:301 楼(回复楼主) 赞 +1 |
IP: 117.136.0.*   | 赞 +1 [1]seeker99   2013-10-3 11:31
TOP!

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