在这里我整理我最近使用ImageJ软件自动数细胞以及定量分析荧光强度的步骤.

ImageJ的主面板:

打开文件

File ￫ Open ￫’.zvi’

先把2D的所有图叠加起来,选项选max intensity

Image ￫stacks ￫ 3D project

复制一张图:

Image ￫duplicate

调整Thereshold,实际上是选择想要纳入计算的细胞的区域,选定的区域会用红色高亮标记:

Image ￫Adjust ￫ Threshold

如果觉得背景太强可减去背景:

Process ￫ Subtractbackground

当红色高亮标的斑块就是想要的细胞时,点击Apply

Image ￫Adjust ￫ Threshold￫ apply

有些细胞叠加,可用watershed自动划为两块斑块.

Process ￫ Binary ￫ watershed

设定参数,在这里redirected to...不能选择已经标记的这张图,实际上这张已经被转换为二进制图,只有黑和白二色,要选择adjust thereshold之前的那张,这就是为什么3D Z-stack之后要多复制出一张图.

Analyze￫ Set measurements (Redirected to… greyscale image)

然后点击

Analyze ￫ Analyze particles

我的细胞大小大概是5μm,我手动画了个圈面积大概是250pixel^2,所以这里我选

size是250-infinity.因为我只感兴趣荧光平均值,如果要定量细胞大小,可能要选250-350,否则

有些叠在一起的细胞会被当做一个细胞来计算

Size(pixel^2)=250

Soma size=5 μm ^2

5μm=31.25 pixel

5 μm ^2=244pixle^2≈250pixel^2

show里面选择outline也很好,可以自动圈出细胞

Show: outlines￫ OK

过几秒钟,这个图就出来了同时还有result 和summary,是excel表格,可以保存.

然后就可以得到图片中细胞数量,荧光强度平均值,最大最小值等等数据.看这张圈圈图,还是很帅的,呵呵.这些步骤还是很烦的,小水獭刚弄的时候几次想放弃,步骤太多,前后次序不能乱,小水獭表示为什么不能更加简便一些,不就是画圈圈么,汗//b不过处理了50张图以后,小水獭表示短期内还是能记住这些步骤的,于是在博客里保留一个中文使用说明,以助他日之用.

主要参考的是第一篇文献(我会告诉你我基本是翻译第一篇文献么,╭(╯^╰)╮哼~~~),第二篇给了很好的调整的提示.

等我写完了之后,我想,以前别人也肯定会遇到同样问题啊?!然后google了一下(Image J 荧光),科学网,小木虫都有的:

http://bbs.sciencenet.cn/thread-210524-1-1.html这篇步骤特别清楚.

早知道就google中文的了,google(Image J, fluorescence quantification)只找到英文步骤,其实挺难搞懂的.

参考文献:

http://www.unige.ch/medecine/bioimaging/tricks/imagejtutorials/Quantification.pdf

http://sciencetechblog.com/2011/05/24/measuring-cell-fluorescence-using-imagej/