首先要祝贺我的文章《Effective Extraction and Assembly Methods for Simultaneously Obtaining Plastid and Mitochondrial Genomes》终于被接受，虽然投的杂志是PLOS ONE，我仍然很高兴。第一，这是我的第一篇SCI，不管怎样，这毕竟是我的处女作；第二，文章投得出奇的顺利，期间只做了几个简单的修改；第三，也是我最开心的一点，这是我思想的创新，虽然看上去很简单但真的非常实用，在此我将基于这一点对文章做一简单介绍，希望得到大家的认可。

       我的文章写了一整套包括细胞质DNA提取（线粒体和质体）、DNA纯度评估及测序量预测、测序及组装的方法，用该方法可以很轻松地同时获得线粒体和质体序列。该方法不需要传统的超速离心，并且可以用1G Hiseq2000 数据组装出完整的线粒体和质体，将花销压缩至2000-3000。实现了快速高效的质体和线粒体测序，特别适合大规模的线粒体和质体研究。

       细胞质DNA分离：我把我的方法称作部分浓缩法。说出来都有点可笑，我曾经也像其他人一样，天天分离线粒体、质体，可是不管怎么做效果总是不理想，后来想到了这套办法。很简单，我只分离了粗制线粒体和质体混合物来提取DNA，做过的都知道，细胞内质体远远多于线粒体，所以我用了比较高的离心力去除细胞核和碎片，当然包括一些部分质体，这样就可以去掉很多核污染。其次就是材料，得尽量去选那些线粒体含量较高的组织，这样有助于提高线粒体DNA的比例。

       纯度评估和测序量预测：相信大家曾看到很多人用PCR和酶切做纯度评估，这两种方法只能定性说纯度高低，并不能说mtDNA和ptDNADNA所占的准确比例。我引入了一个对照载体，所以将其称作载体对照法。我将分别来自线粒体、质体和核基因组的3个单拷贝基因构建在一个载体上，通过qPCR很简单就能确定当有一个拷贝的核基因组时，线粒体和质体基因组各有多少拷贝，参考物种基因组大小，算出mtDNA和ptDNA的比例。进一步预测在一定测序深度时所需的测序量。

        测序：这是最简单的，因为需要组装，当然选择读长长一点会更有利些。

       组装：我给我的组装方法称作两步法组装。第一步，组装叶绿体。因为最终的测序数据中叶绿体一般测序深度都大于1000，而线粒体则在100左右，核基因组只有1左右，所以我用很高的覆盖度参数，使得来自核基因组和线粒体基因组的reads此时根本组装不成contig，从而避免对质体序列组装的影响。第二步，组装线粒体。此时我已经得到质体序列了，我可以利用组装好的质体基因组把那些来自质体的reads从去掉，以前有人试图这么做，但是他用了已经发表的质体序列，个体之间的变异使得这种去除肯定是不完全的，更不要说物种差异。采用自身的质体序列可以很好的去除质体reads，当然也会有部分高度同源的线粒体reads被去掉，后边会讲到。得到去掉质体reads的数据我进行线粒体组装，此时没有质体reads干扰，准确度大大提高，可以说结果是无误的。最终由于去掉了一些同源的线粒体reads，导致出现gap，此时我们就要用类似步移的方法去完成。我们把一端比对到gap两边，一端比对不上的reads抽出来补洞，每次延伸一些，循环几次，gap就被补上。最后我们可以通过PCR来验证组装补洞的准确性。

       讲到这大家应该明白这是一套多么简单办法，一个简单分离加一个稍加繁琐的组装，用极少的钱办做多的事，免受细胞器DNA分离的痛苦，并且一次完成两个器官的测序，这就是其价值所在。另外，这种纯度评估也不仅局限于此。比如说，线粒体含量可能与植物的育性有关，怎么才能给材料的线粒体含量做定量分析，我想这个方法应该算是简单有效了。当然，其还可用于很多有关线粒体和质体的研究。

       最后，我想说，PLOS ONE备受争议，大家也没必要排斥他，其实影响因子已经说明了一切，那里也有一些值得我们学习的东西，一些创新的东西。我不敢说我的文章有多么出众，但是我的确不是在给大家罗列数据，搞数据堆积，我希望大家认可这个小小的创新，给大家带来方便。不要因为他“出身贫寒”，失去其存在的价值。

原文链接http://www.plosone.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pone.0108291