博文
“推销自己”，迎接批评，长长学问
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1958年我奉命到中国科学院植物所请教汪发瓒先生。先生拿出他撰写的当时还未出版的苔属(Carex, 莎草科)的检索表，要我回校好好学，不明白的再问他。“学了再问，就是学问”。从此学了问了五十年。退休后学上网，看到各种精彩和尖锐的文字。特别是博客，读了收获很大，学问大进。希望能读到和自己工作和经历有关的文字。最近获准在“科学网”上做客，根据院长“推销自己”的指示，上次写了简历和出版物，得到同事蒋高明的鼓励。这次将最近为“所志”写的近二十年我和我的同事、学生的研究工作初步总结上网，欢迎批评。以后再对某些问题发表我的意见。
第七节 植物适应逆境的多学科多层次整合研究
本研究根据汤佩松的“创新植物学”，应用分子生物学的原理和方法在植物细胞、器官、整体、群体和生态系统等层次从形态、细胞、生理、生化和生态等多学科综合探讨植物对逆境的适应。
一． 应用分子标记研究植物多样性和两种不同水平进化的发现
1. 杨属植物和栽培芸苔属植物同工酶的对比研究
同工酶可揭示酶编码序列的变化。已知过氧化物酶的多样性与抗逆性和形态建成有关。1981年报道杨属全部5组20余种、亚种、以及种间杂种和无性系的酶谱有高度的多样性，可用来鉴定种、亚种，甚至形态上无法分辨的欧美杨无性系。该属经过近亿年的进化在中国得到充分的发展和分化，适应于高山、沙漠、湿地等各种环境。将小叶杨(耐旱耐盐)和钻天杨(耐湿)的杂种进一步杂交得到大量F2植株，酶谱统计分析证明酶带呈互显性遗传即等位酶。说明杨属形态和生理特性分化过程中过氧化物酶基因发生重复和突变。离体培养的山新杨愈伤组织在分化和脱分化过程中同工过氧化物酶发生有规律的变化，基因表达变化早于形态发生。
为了进一步了解形态分化和过氧化物酶基因的关系，电泳分析了具有明显平行形态进化的栽培芸苔属6个细胞组群(cytodeme)的百余品种植株根、茎、叶和叶柄。根的酶谱包括其他器官的酶带。同一组群内，不论是根，还是茎、叶柄或花序有何特化，各种的酶谱没有区别。例如苤蓝、园白菜、菜花、茎椰菜、甘蓝型油菜，根、叶、花序形态特化，可分为不同的种，但根过氧化物酶谱完全一样。6个细胞组群中3个异源四倍体是由其他3个二倍体两俩合成，酶谱也表现出两俩的叠加；因此全部酶带都有基因编码并可定位在相应的染色体组(genome)。总之，芸苔属栽培种在形态上发生的各类显著变化，并不伴随过氧化物酶基因的变化，与杨属的情况截然相反。显然需要研究更多分类群，最好是对比一个大分类单元中的不同分类群。
（主要研究人员：胡志昂，王洪新，李玉斌，高丽锋，崔澂）
2．裸子植物同工酶和种子蛋白的变异及表型和分子进化的分歧
参加王伏雄主持的院重大项目“裸子植物系统发育和进化”(1981-1985)研究中，1983年报道了全部10属50余种松科植物针叶的同工过氧化物酶。松科各属是按同样的形态特征进行分种，并适应于不同生境；换句话说，各属有近似的形态和生理等表型的分化水平。但各属的酶谱分化水平差别很大。将两种植物酶谱不同的带数除以两者总带数，定义为种间酶谱距离。发现各个属的平均种间酶谱距离与属的历史呈正相关，即酶谱变异有相对稳定的速率。与国外报道松科一些种属的抗原距离数据相似。证实植物的分子进化和动物一样有稳定速率。早就清楚生物的表型进化速率随环境而变，因此提出植物的表型进化和分子进化也是不同机理的两个过程。普遍推测表型进化是基因调节序列的变化，受环境影响，选择起主要作用，称达尔文进化。而分子进化当时仅指编码序列的变化，是中性突变的随机固定，只是时间的函数，环境的选择不起主要作用，称“非达尔文进化”。松科10属50种植物的种子蛋白多样性证实这个结论。杨属与栽培芸苔属植物的表型和分子进化的分歧在同一个松科得到进一步的确证。既然生物表型是适应进化的产物，又是分类的主要依据，文章提出形态建成遗传调节的历史应该是进化研究的核心。还报道了红豆杉科、三尖杉科的同工酶和种子蛋白多样性。
（主要研究人员：胡志昂，王洪新，阎隆飞，刘长江）
3. 大豆、野大豆群体等位酶遗传结构和种子蛋白的变异
在杨属研究中曾观察到种内不同植株之间的同工酶变异，遗传多样性的进一步深入始于野大豆自然群体的研究。1983-1986 钱迎倩组织了大豆和野大豆研究的所内外协作，所外有吉林省和黑龙江省农科院的大豆所。1983报道检测大豆Ti（胰蛋白酶抑制剂）和Sp1（β-淀粉酶）各等位酶方法的改进。主要是用了新染色步骤，可一板同时显两种蛋白，适合群体大量样品的分析。报道了中国栽培大豆主要生态类型82代表品种的Ti、Sp1和 Ep（种皮过氧化物酶）的基因型，讨论了地理分布。1985报道北京地区野大豆13个自然群体1300植株的Sp1和Ti都只有一个等位，证明野大豆在自然条件下是严格自交的。各等位基因频率的地理分布与环境条件没有关系，系中性突变。据此提出了野大豆基因资源保存的取样策略。文章后来被外国学者反复引用，日本和韩国群体的数据证实本研究结果。该取样策略也被他人在论文和专著中引用或重复。虽然该文根据形态进化与分子进化的分歧，提到特殊形态变异应该单独取样；但当时制定取样策略的理论，即等位酶频率的地理分布代表了全部基因包括决定资源特性的基因的分布，是很成问题的。以后的研究证明具有重大资源意义的生理和生化变异如抗逆性等，其地理分布与等位酶中性突变频率的地理分布是不同的，取样策略有待修正。
期间与两个大豆所合作发表了一系列大豆及其近缘种遗传变异的论文。大豆属两亚属全部种的种子蛋白电泳分析表明，以中国为分布中心的野大豆虽然其副大豆球蛋白少数亚基有变异，但和栽培大豆蛋白极为接近，组成Soja亚属合理。以澳洲为分布中心的Glycine亚属虽有很多种，种内种子蛋白也有变异，但与栽培大豆的种子蛋白组成相去甚远。几年后国外有类似报道。全国野大豆Ti和Sp1 等位酶数据支持黄河中下游是大豆起源地的论点。值得注意的是全国各地野大豆的光周期反应及其温度依赖性表现出的地理关系，表明光周期反应完全是一种适应性状，与酶和蛋白的基因频率随机分布格局不同。说明生理特征和形态一样是适应性状，与编码序列的中性特征不同。有关研究由徐豹总结，评为农业部科技进步二等奖，植物所为第二完成单位。还发表了栽培大豆代表品种和部分野大豆群体脲酶等位酶遗传变异的论文，这个性状具有资源价值。
大豆属分类上归菜豆族菜豆亚族。种子蛋白的研究在90年代延伸到整个菜豆亚族。菜豆属与豇豆属在植物分类学历史上是一个长期争论的题目，因此称为Phaseolus-Vigna Complex。Phaseolus各个种内种子蛋白多样性极高，Vigna栽培种内没有检测到多样性，因此支持将绿豆、赤豆等从Phaseolus移出归Vigna的观点。
（主要研究人员：胡志昂，王洪新，张义君）
4. 两种进化分歧的实际应用：种子蛋白电泳鉴定作物品种
上面提过同工酶电泳可以用于鉴定形态十分相似的杨树种质。1986-1989我们先后报道了用种子蛋白电泳鉴定形态上不能区分的菜豆和小麦的品种，特别是发明用酸性乳酸钙梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳区分玉米杂交种和它们的亲本自交系，得到国际同行的好评，进行了技术转让。工作总结为“植物种子蛋白多样性和品种鉴定”的综述。1990年2月通过成果鉴定，1991年所学术委员会通过作为重要成果上报，刊登于“科学技术成果公报”1994年第二期，11月接到国家科委发的证书。
（主要研究人员：胡志昂，王洪新）
二.植物逆境基因的克隆和表达
1. 植物培养细胞盐适应蛋白和渗调蛋白基因克隆及其调节
相对于形态特征是复杂的多基因数量性状，抗逆性可能比较容易研究。进化根本上说是生物通过变异适应逆境的历史。通过比较不同环境中生长的同一物种的不同个体，可能找到决定抗性的分子。1983国外报道用增加培养基NaCl浓度的方法所得到的突变耐盐细胞系诱导新的蛋白，为从蛋白通过cDNA 克隆抗逆基因创造条件。基因克隆俗称遗传工程，我所是我国最早开展研究的单位（1974- 1979）。当时主要是查阅文献和建立各种实验方法，唐佩华任组长。胡志昂1978年以固氮研究室的名义发表我国植物基因工程的第一篇综述：高等植物遗传工程的载体问题。1982和1984 先后应植物杂志和北京农业科学的要求分别连篇介绍基因工程和农业遗传工程的基本概念和进展。1985我国重新发起系统的基因工程研究。因为有上述理论和实验的基础，我所承担了国家七五科技攻关项目，其一是：植物抗旱耐盐基因的鉴定和克隆专题（1986-1990）。胡志昂负责该专题和其中一个子专题：培养植物细胞抗旱耐盐基因克隆。1989年首先报道胡萝卜培养细胞在适应追加NaCl的培养液后诱导一个66KD的蛋白，进行了纯化。因为分子量大，含量低，很难克隆。PEG（聚乙二醇）不能诱导该蛋白，因此定名为盐适应蛋白。1991年报道培养的大豆细胞在外加NaCl或PEG 的培养基中诱导一系列新的水溶性蛋白，含量最高的一个与美国盐湖城NPI的NP24（渗调蛋白）很类似。从NPI得到NP24 cDNA 克隆，用羟基毛地黄苷非放射性标记为杂交探针，通过原位杂交从番茄总DNA文库鉴定到一个同源克隆。用NP24 cDNA为探针，揭示出番茄和耐盐的秘鲁番茄渗调蛋白基因的酶切片段长度多态性。进一步发现渗调蛋白基因在植物界广泛分布。并证明NaCl增加植株地上部分渗调蛋白基因的转录。1991-1993承担国家基金委高技术项目“渗调蛋白抗旱耐盐基因工程”，构建渗调蛋白cDNA 反向插入的重组分子，转化到土壤杆菌，进一步转化烟草。Northern杂交证明植株根的渗调蛋白基因的转录被阻断，但耐盐性没有明显下降。可能渗调蛋白基因只是起一种普遍的防御作用。国外后来报道渗调蛋白基因超表达的转基因马铃薯提高了抗病性，没有提及抗盐。我院发育所金振华克隆了胡萝卜细胞胚胎发生系列cDNA，国外报道其启动子负责对干旱应答。和谭克辉合作，用羟基毛地黄苷标记胚胎发生cDNA,发现这些基因在植物界广泛分布，它们的表达主要在生殖器官，可能起预警保护作用。除了原始论文外，还发表了“植物抗旱耐盐基因研究进展“综述。有一文介绍非放射性标记和检测方法，并为孙敬三、桂耀林主编的“植物细胞工程实验技术”写了“转化体的鉴定--非放射性标记和检测方法”一章。
（主要研究人员：胡志昂，王洪新，董夫贵，曹和平，谭克辉）
2.复苏植物牛耳草脱水和复水过程的基因表达
上面提到的基因研究的步骤，关键是准确地鉴定决定性状的基因的蛋白质产物，这并不容易。信使RNA差异显示能绕过蛋白从鉴定cDNA直接到基因。原理是将生物材料分别置于不同的条件下（如正常和逆境），分别提取其总RNA并逆转录为cDNA。然后立即用一系列引物进行PCR。分别用凝胶电泳分离，逆境材料有而正常材料所没有的电泳条带可能是逆境专一的cDNA。原方法在逆转录物扩增时加放射性标记物，电泳后用放射自显影显示cDNA条带。底片和胶重合，切取与底片上显示差异表达条带相应的胶条，进行提取和克隆。因为自显影需要不少时间，胶会收缩，DNA带又很多很密，不容易对准。1999年在研究复苏植物基因表达过程时，我们发明用胶直接银染代替放射自显影进行信使RNA差异显示的方法，鉴定出大量与水分状态相关的基因。一则避免了用同位素的麻烦，二则银染带就是cDNA,看得准，不会切错。。复苏植物生长在水分条件周期性激烈变化的生境，干旱时失去90%以上水分进入假死状态，有水时很快吸水恢复全部生命活动，直至开花结实。被子植物中有复苏能力的不到1%。早在1956年胡志昂就发现生长在假山上的牛耳草（苦苣苔科）有这种能力。而且植株的所有器官，即使是离体的，甚至很小的叶碎片都可容忍多次反复脱水复水，为别的复苏植物所不及。如果能揭示复苏的本质，用转基因使作物获得复苏能力，可望育成高抗干旱的作物品种。1998匡廷云主持的“高效光合作用及其在农业上的应用”973项目包括有抗逆的内容，有幸得到资助，研究牛耳草光合特性和抗旱基因表达。光合作用是植物对干旱最敏感的生理过程，因此首先比较研究了牛耳草和无复苏能力的近缘植物在脱水和复水过程各种光合功能的变化，包括光合放氧、吸收光谱、荧光激发光谱、荧光发射光谱、叶绿素a荧光诱导动力学参数等。证明光合活性是复苏状态的良好指标。首次报道了类囊体膜叶绿素蛋白复合体在脱水和复水过程中保持完整，可能是叶绿素保持型复苏植物的主要特点。叶黄素循环等色素的测定，表明即使在极微弱光下充分脱水的叶片玉米黄素显著积累；而黑暗和DDT处理专一消除这种诱导，表明叶黄素循环起了光保护作用。该研究的主要内容是鉴定和克隆与复苏有关的基因。用发明的银染mRNA差异显示方法，鉴定了牛耳草离体叶片脱水复水过程至少有183个基因发生诱导或阻抑。克隆和测序了10个序列，表明牛耳草脱水过程中诱导表达的基因可能涉及脱水胁迫的信号转导（G蛋白、蛋白激酶等）、基因调节的级联作用（cascade）中的VP3，MAD3基因、调节细胞结构（包括细胞质膜）在脱水胁迫中的稳定性的基因等。最近发表了牛耳草离体叶脱水和复水的蛋白质组学分析。蛋白质双向聚丙烯酰胺凝胶电泳可重复地检测到223种蛋白。挑选脱水增加表达的14个蛋白经胰蛋白酶消化后用质谱分析通过NCBI数据库搜索得到鉴定，包括谷胱甘肽过氧化物酶和谷胱甘肽S-转移酶。这二者的脱水诱导与谷胱甘肽的积累一致，说明谷胱甘肽的抗氧化功能在获得抗脱水能力起重要作用。前后有多位研究生参加本工作。其中邓馨后来在德国马普协会植物育种所从事博士后研究，用基因芯片筛选出大量差异表达的cDNA,现回植物所带领她的研究生们继续牛耳草的研究。
（主要研究人员：胡志昂，邓馨，杨文龙，姜国强，王洪新，温效刚，匡廷云）
3.超级稻光抑制基因克隆及其遗传起源
光抑制是绿色植物重要的逆境胁迫因子之一，在没有其它胁迫因素时，光抑制单独就可使光合生产力降低10%。水稻在生育后期往往遭遇强光，所以光抑制胁迫也一直是水稻超高产的严重制约因子。根据匡廷云的统一布置，进行了超级稻耐光抑制基因克隆。运用银染mRNA差异显示技术，以耐光抑制的超级杂交水稻两优培九及其母本培矮64S、父本9311为试验材料研究杂种光抑制过程中差异表达的基因并探讨其遗传来源。根据银染mRNA差异显示电泳图谱相应位置上光抑制处理与未经光抑制处理的对照样品逆转录扩增产生167个差异表达cDNA。差异条带有来自父本或母本或双亲，说明光抑制是一个很复杂的过程，杂种配制要考虑双亲的遗传背景。其中一个序列（AY189693）编码水稻细胞质单脱氢抗坏血酸还原酶。在光抑制条件下，该酶还原单脱氢抗坏血酸而使细胞中的抗坏血酸维持在较高的水平，参与“水－水循环”并维持活性氧清除和过剩激发能耗散等光保护机制的顺利运转。
结论：从cDNA和蛋白质两方面都证明各种植物都存在数以百计的抗逆基因，通过一系列基因表达的变化在细胞、组织和植株水平上对各类逆境做出反应。
（主要研究人员：胡志昂，郭晋隆、姜国强，阳文龙，王洪新，匡廷云）
四.逆境植物群体的形态、生理、基因组的多样性和适应
1. 辽东栎和蒙古栎群体在蛋白和DNA水平上的变异与环境
1989年院生物局发起生物多样性研究，八五期间组织了一系列重大项目，为分子生物学深入到植物群体和生态系统的适应研究提供极好机会。根据院重大基础性研究项目负责人陈灵芝的建议，用分子标记研究温带落叶阔叶林建群种辽东栎的遗传多样性及其生态适应性，王洪新负责该专题。生态学早就揭示水分是栎树生长和分布的限制因子，因此选择水分条件较好的北京东灵山中国科学院北京森林生态系统定位站标准样地和较干旱的毗邻河北省的崖口群体进行比较。13种同工酶30位点的统计分析表明辽东栎有很高的遗传多样性。不同水分条件群体遗传结构很接近，遗传距离仅0.029，说明两者间有强大基因流。群体间少数位点基因频率的差别，当时解释可能与环境适应有关；现在看更可能是崖口群体作为边缘群体，丢失4个稀有等位。不同年龄段树木的统计结果说明砍伐后有良好的自然更新。结论是辽东栎的遗传多样性为其成为优势种并具自然更新能力提供了遗传基础。
为了更好地用随机扩增多态DNA（RAPD）检测植物群体DNA多样性，对原Williams等（1990）方法进行了改进。主要是用聚丙烯酰胺凝胶电泳代替琼酯糖凝胶电泳，增加分辨率；用银染代替溴化乙啶染色，提高灵敏度。降低加样量到1/10或更低的情况下，显示带数增加一至数倍。用小钻杨自交F2群体对改进方法所检测的RAPD条带进行了遗传分析，证明多数是显性遗传。用RAPD，也用DNA 扩增指纹检测东灵山辽东栎更多群体的DNA多样性。用Shannon指数统计，发现多样性很高，95%在群体内，群体间只5%，证实其异交性。中心群体又高于边缘群体，现在看是边缘效应。
辽东栎的分类地位是有争议的，有人定为蒙古栎的变种。分种的主要标准：蒙古栎的壳斗包坚果到1/2，苞片有瘤状突起，叶脉7-11对；而辽东栎的壳斗包坚果不到1/3，苞片无瘤状突起，叶脉5-8对。东灵山的辽东栎：叶脉5-11对，苞片有的略有瘤状突起，有的平，壳斗大小特性也在两个种之间。为了从分子水平提供证据，从黑龙江省帽儿山东北林业大学实验林场采集典型的蒙古栎，在山西省关帝山庞泉沟自然保护区采集典型的辽东栎，会同北京东灵山的样品进行群落学、形态、同工酶和DNA对比。发现生境、群落结构、叶和果实形态，甚至植株高度都有连续性变化。172个DNA位点，没有一个是群体专一的。仅26个位点（占15%）在群体间有频率的显著差异。与三个地区的Shannon统计多样性数据完全一致，即85%变异在群体内，15%在群体间。26位点中又有23个，其频率表现为地理渐变性（cline）。有一个位点OPD08434可能最典型，山西群体频率为100%，北京群体为50%，黑龙江蒙古栎群体没有检测到，看来是辽东栎专一的。该位点已克隆和测序。全部数据表明相隔一千多公里的范围内两种栎树存在双向的强大基因流。与同工酶是中性不同，DNA位点的地理渐变性暗示在大量中性突变中可能存在适应水分变化的位点。该专题属于“动植物遗传多样性”课题，由施立明、胡志昂负责。课题有一个任务是编写专著“中国动植物的遗传多样性”。该书于1997年出版，胡志昂、张亚平主编。
（主要研究人员：王洪新，钟敏，恽锐，魏伟，胡志昂，钱迎倩）
2. 锦鸡儿群体的形态、蛋白、DNA多样性及其对环境变化的适应性
根据国家科委攀登项目（1992-1996）负责人张新时的提议，“鄂尔多斯高原灌
丛优势种生态遗传学研究”专题研究毛乌素地区的中间锦鸡儿群体。该地区是从草原到荒漠的生态过渡带，地质上也很复杂，形成不同的景观生态类型，中间锦鸡儿都有分布。因为徐朗然等用杂交证明明中间锦鸡儿可能正如定名人匡可任估计的是小叶锦鸡儿和柠条锦鸡儿的杂种，因此在采集样品时也包括其他两种。植物志记载当地均称柠条的上述三个种的主要区别是荚果的长度：小叶锦鸡儿的最长，超过3.5厘米；柠条锦鸡儿最短，小于2.5厘米。中间锦鸡儿居中。毛乌素沙地中间锦鸡儿群体荚果长度分布基本上介于两种之间，但有很多短于2.5厘米和大于3.5厘米的。每个群体可能是三个种植物的混合群体，也可能是三个种的杂交群体，即杂种带。柠条种子蛋白，同工酶和RAPD均显示毛乌素沙地柠条群体有极高水平的遗传多样性，而这些变异大部分发生于群体内；不同景观生态类型之间只占不足10%。群体遗传结构说明中间锦鸡儿是异交的。同一植株不同种子的种子蛋白和同工酶呈现多样性和Mendel式分离，直接证明其异交性。毛乌素沙地柠条在分类上最好的解释是从西部适应沙漠生境的柠条锦鸡儿向东分布，东部适应草原生境的小叶锦鸡儿向西扩散，在毛乌素生态过渡带相遇形成适应过渡带生境的杂种带。发现有10个位点表现环境水分关系的渐变性（cline），即环境条件最好的滩地频率为零或很小，随环境恶化而逐渐增大甚至到1。利用柠条自然条件下开放授粉的特点，有可能对同工酶进行遗传分析，并从各个群体的基因频率和基因型频率计算出异交率。发现水分条件最好的滩地群体是100%异交的，与小叶锦鸡儿相近。而沙丘群体只有39%异交，与柠条锦鸡儿类似。水分中等的群体居中。而从荚果里的确发现一种象甲，表明昆虫传粉导致异交。随着生境逐渐干旱，首先减少传粉昆虫，进而增加自交率，影响基因频率，甚至基因固定。因为逆境导致某些RAPD频率增加而非减少，所以不能排除与这些RAPD紧密连锁的染色体位点适应环境变化的可能性。
锦鸡儿植株内种子蛋白高度多样性表明其异交性。野大豆和野绿豆植株内的种子蛋白没有变化是自交的。紫藤和玉兰有低水平多样性，可能是混合繁育系统。因此种子蛋白植株内多样性可为检测植物繁育系统提供一种简单、快速、廉价的方法。
（主要研究人员：胡志昂，王洪新，魏伟，周永刚，钟敏，钱迎倩）
3. 锦鸡儿根瘤菌群的生理生化特性的多样性和生态系统功能
虽然群体是生物适应环境变化的基础，但必须与其他物种组成生态系统才能发挥功能。国际生物科学联盟提出生物多样性科学的核心是研究生物多样性的生态系统功能。胡志昂和王洪新（1998）提出优势种锦鸡儿，两个关键种（根瘤菌和传粉昆虫）与缺水少氮的沙地生境构成毛乌素沙地生态系统功能的基本单位。马克平负责的国家基金委九五重大项目“中国关键地区生物多样性保育的研究”（1998-2002）为毛乌素沙地锦鸡儿生态系统功能研究创造了机会。通过研究毛乌素沙地柠条根瘤菌的遗传多样性，探讨在不同生境条件下植物和根瘤菌的遗传多样性对优势种共生生长的影响。实验包括：1．柠条根瘤菌的遗传多样性，2. 建立人工共生体系，对比不同生境下各种共生组合的固氮和生长。
从毛乌素沙地采集了大量根瘤。分离出数百菌株，经反复转接和细菌学控制条件下的结瘤试验，筛选出能结瘤的菌株。选取其中稳定结瘤的24株柠条根瘤菌进行分析，并与北京农业大学陈文新等提供的十余个已定名的根瘤菌不同属种的参比菌株比较。柠条根瘤菌蛋白质指纹不同于供试参比菌株，独立成群。酯酶同工酶研究结果显示，几乎每个供试菌株都有其特征性酶谱。16S rDNA PCR-RFLP 具有种特异性，是研究细菌种属水平DNA多样性的有效方法。用引物fD1和 rD1扩增的全长16S rRNA基因经4种内切酶消化后电泳分离的银染谱显示很充分的DNA多样性。共产生22种不同的16S rDNA 基因型，属于不同属的参比菌株构成10种，33株柠条根瘤菌有12种基因型,反映毛乌素沙地柠条根瘤菌丰富的遗传多样性。其中基因型2占42.4%，可能它是毛乌素沙地生态系统中最具竞争力的。全序列分析（搜索号 AY029336）表明，基因型2的柠条根瘤菌很可能是快生型根瘤菌的一个新种。
毛乌素沙地夏季高温干旱缺水少氮限制植物和微生物的生长发育。毛乌素沙地柠条根瘤菌的生理生化测试，发现有些菌株具有极强的耐盐性，多数能在含10% NaCl 的培养基上生长,生长的pH 值范围较宽为5.5-9.0，很多菌株能忍受600C高温。一些生化特性也说明柠条根瘤菌的多样性表现出对毛乌素沙地环境变化的适应。
选择确定了基因型的16株菌分别在人工沙地（模拟毛乌素沙地沙丘生境）和一般的华北土壤（非沙化对照）上与分属三种锦鸡儿而来自不同景观生态类型的植物交叉接种。当年秋末测定株高, 地上部分和根的干重及根瘤重量，从含氮量估算固氮量。初步结果表明在沙地没有接种根瘤菌的对照苗全部死亡。结瘤植株的生长和含氮量随植物和菌种而异。柠条锦鸡儿生长普遍优于其它两种，与任何基因型的根瘤菌都可以建立良好的共生关系，而与基因型 2 建立的共生最为有效，植株及根瘤生物量远高于其它共生组合。锦鸡儿种间和种内都有差别，不同菌接种也有显著差别。而在对照土壤中，各种差别均不显著。说明生物多样性的生态系统功能的表达依赖生境。实验结果证明沙地锦鸡儿生态系统的建立必需植物和根瘤菌共生，两者的遗传多样性的确影响生态系统功能（包括氮输入、碳同化和能量循环）。根瘤菌的生物量很小，但通过结瘤固氮和合成生长素等大大促进缺氮植物生长从而发挥显著的生态系统功能。证明根瘤菌是毛乌素沙地生态系统的一个关键种，促使柠条成为生态系统的优势种，并通过与优势种共生放大了它的生态系统功能。
还曾与动物所蒋志刚合作，指导他的研究生从rDNA序列研究普氏原羚的系统位置和群体遗传学，说明分子生物学理论和方法对动植物、微生物的普遍适用性。
（主要研究人员：胡志昂，高丽锋、王洪新，李玉斌，邓馨）
4. 野大豆盐渍群体同工酶、DNA和耐盐性的多样性
前人报道有些植物能入侵废矿区快速形成抗性群体并设想是正常群体里预先存在的个别抗性植株通过奠基者效应形成的。承担院重点项目“适应进化的分子基础”（1993-1995）为早期的野大豆遗传结构研究向适应进化深入。检测黄河入海口野大豆盐渍群体的耐盐性、同工酶和RAPD，与其上游垦利县城附近的正常群体做比较，了解盐渍对植物群体遗传结构的影响。现在的入海口是1976年黄河最后一次改道后从渤海中形成的，到1993年取样，盐渍群体的历史不超过17年。耐盐性的测定发现盐渍群体竟有盐敏感植株；其平均耐盐性之高于正常群体，是因为出现高耐盐个体。就是说盐渍环境增加了群体耐盐性的多样性。同工酶测定证明两者遗传结构很接近，盐渍群体仅仅是丢失了几个稀有等位，说明盐渍群体是边缘群体，来自上游正常群体，因为野大豆随水流散布。还说明盐渍并没有显著改变植物的基因编码区。RAPD分析表明即使只用10个引物, 便可将盐渍种群里每一个植株区别开。抗性群体在抗逆性和DNA水平的高遗传多样性与国外多数报道一致，说明植物适应逆境过程不是遗传多样性降低的奠基者效应，相反，一定有突变发生。1997的报道没能找到与抗性水平有关的分子标记，认为分子标记至少大多数是中性的。扩增产物用限制性内切酶消化能提高检测灵敏度，但还是没有找到与耐盐性相关的DNA片段。1999年用另外一系列引物，发现6个RAPD与野大豆抗盐水平相关：凡是高抗植株有全部6个标记，中等抗性的有其中2至3个，盐敏感的1个也没有。由此提出高耐盐植株是通过几次突变逐步积累所致。
基金委自由申请项目“野生大豆盐渍种群转录因子DREB的多样性与逆境适应”（2004-2006）继续深入进行适应进化研究。根据植物逆境分子生理的最新进展，
特别是转干旱应答转录因子DREB的转基因植物显著增加抗逆性的同时，诱导近百种抗性基因的表达。证实本节第二部分的结论：植物的基因组预存在一系列抗性基
因。因为共同的转录启动子没有得到专一识别的转录因子激活而表现为低抗逆植株。早就有人报道逆境促进逆转录转座子转座，最近又报道转座能诱导新基因形成，
因此设想逆境诱导的转座有可能激活转录因子的表达随即激活一系列预存在的抗性基因，快速形成抗性群体。2000年李玉斌攻读博士期间从野大豆RAPD产物克隆了
一个全长的Gypsy逆转录转座子整合酶基因INT序列，阳文龙重复克隆和测序，定名为GsINT（搜索号AY688676）。DNA杂交表明，群体内各植株该序列有多个拷
贝，植株间存在限制片段长度多态性。以后根据大豆DREB基因(GmDREB1)的保守序列设计一对引物GmDF1和GmDR1，从野生大豆植株DNA扩增到一段128bp保守序
列，与其它植物的DREB1同源性很高，定名为GsDREB1。根据所得的这两个序列，设计并合成若干引物，检测野大豆基因组中GsDREB1的5'上游是否存在逆转录
转座子。结果显示有十几个INT位于DREB的5'上游，从-370到-3000bp或更远.DNA杂交表明扩增的DREB与INT之间的间隔序列是多拷贝的而且与GsDREB1高度
同源。群体内不同植株显示间隔序列长度的多态性，说明盐渍条件下该逆转录转座子发生了多次转座。克隆了部分间隔序列并测序，证明有的确实是植物的Gypsy
逆转录转座子整合酶基因。
为了克隆野大豆群体DREB全基因，先用EcoRI消化植物DNA，再用连接酶使限制片段自行环化。设计一对反向引物：InvDF1和InvDR1。用反向PCR从128bp向
外延伸获得完整基因。考虑到两个反向引物向内的序列也可能有变异，也为了对测得的序列进行确认，从测得的序列又设计一对引物GsDF1和GsDR1，再次扩增和
测序，证实DREB基因序列。从高、中、低耐盐性共计16个野大豆植株DNA里克隆和测序了1585-1600 bp全长GsDREB(搜索号EF051448 - EF051463)，包
括5’上游692-703 bp,编码区507 bp，3’下游384-389 bp。每一个植株都有其特有的序列，基因编码区差别极少，推导的氨基酸序列完全相同；变异集中在
5’和3’。此结果与玉米及其野生种驯化基因的多样性分布相似。可能自然条件下植物耐盐性的适应进化和玉米驯化基因的调控进化类似，DREB表达的调节被5’
更上游的逆转录转座子“丛林”所控制。由此提出逆境适应进化分子机理的下列假说。正常群体主要由非抗性植株组成，预存在数十至百余种抗性基因，但因缺乏
转录因子的激活而维持低活性。当环境发生变化处于逆境条件时，群体内植株转座频率大大增加。转座子，主要是各类逆转录转座子非定向地插入基因5'上游
或其编码区，引起DNA片段缺失、重复和倒位等。多数没有改变基因表达，为中性突变。少数插到转录因子基因5'上游的一些位置而促进或抑制其表达，由此引发
转录因子所控制的一系列抗性基因表达的增加或减少，结果在短时间内就逐步形成包括高抗性植株在内的有多种抗性水平个体组成的抗性群体。如转座到决定形态
发生的转录因子调节区也可能同时发生各种形态变化，如玉米驯化基因的进化。在黄河入海口发现有盐腺的野大豆，可能是这类突变和选择导致更高水平盐适应
的结果。逆境促进的逆转录转座子插入转录因子基因改变逆境应答基因网络的表达变化可能是植物应答环境变化导致生理和形态快速进化的基本分子机理。本假
说包容了选择论和中性论，解释了“分子进化”和表型进化的分歧，构成一个统一进化论的框架。
（主要研究人员：胡志昂，姜国强，王洪新，张芹，魏伟，李玉斌，阳文龙，邓馨，钟敏，钱迎倩）
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