原名：Blueberry polyphenols alter gut microbiota & phenolic metabolism in rats

译名：蓝莓多酚对大鼠肠道微生物区系和酚类代谢的影响

期刊：Food & Function

IF：4.171

发表时间：2021.2

通讯作者：Connie M. Weaver

通讯作者单位：美国普渡大学

1 肠道微生物区系

原料配制、日粮和灌胃剂量中的酚含量如表1所示。在基线时，不同组之间的微生物群组成相似，厚壁菌门（Firmicutes）（78%）、拟杆菌门（Bacteroidetes）（19%）和放线菌门（Actinobacteria）（2.2%）是最丰富的门（图1a）。处理90 d后，蓝莓多酚诱导微生物群落结构发生明显的剂量依赖性改变。此外，高剂量组变形杆菌（Proteobacteria）数量增加。在研究结束时，通过物种丰富度和均匀度的评估，分析了每个样品中肠道微生物物种的多样性。与对照组相比，BB（Blueberries）组（灌胃0 d）和中剂量组的丰富度增加，而高剂量组减少（图1b）。使用多种指标分析样品间肠道微生物区系结构的差异，显示高剂量组大鼠与其他处理组大鼠之间有明显的分离。为了可视化差异并确定治疗组的平均值是否真的不同，使用主坐标分析绘制了第90 d的样本（图1c）。PCoA图显示，高剂量组大鼠肠道菌群与其他处理组明显分离。除高剂量组外，中剂量组肠道菌群与其他各组差异显著。通过Lefse和ANCOM进一步分析了不同的类群，观察到了几个显著的差异（图1d-g）。高剂量组表现出最显著的差异，几个类群（如多雷拟杆菌（BacteroidesDorei）和绒梭菌属（Lachnolostridium）显著富集，其他类群（如（Rickenellaceae RC9 gut和Eubacterium xylanophilum 显著减少。此外，中剂量组的种类最丰富。在90 d时，BB组与低剂量组比较，发现一个显著不同的分类单元，即Alistipes，其相对丰度在BB组较高。

表1 原料配制和口服灌胃剂量的多酚含量

图1 肠道微生物群的特征。（a）基线和研究结束时大鼠肠道微生物群中门的相对丰度。（b）在研究结束时，Faith的概率分布图说明了研究结束时的α多样性；小写字母表示组间的显著差异。（c）加权Unifrac分析的PCoA图，说明研究结束时所有样本的β多样性。（d-g）在研究结束时，由LEfSe鉴定的几个代表性差异丰富分类群的相对丰度。

2 尿中酚类代谢物的排泄

为了评估90 d治疗过程中酚类代谢动力学的变化，在基线、7 d、15 d、30 d、60 d和90 d收集24小时尿样。在每个时间点总共分析了52种酚类代谢物。其中，36种化合物在至少一个治疗组中是可定量的。酚类代谢产物随治疗和时间点的不同而改变。在整个研究过程中，总酚类代谢物排泄呈现剂量依赖性反应，BB组、低剂量和中等剂量组在开始治疗后7 d内达到最大代谢物产量。相比之下，高剂量组在整个研究过程中表现出代谢物产量的稳步上升（图2a，表2）。低剂量组和BB组的酚类代谢物排泄量相似。然而，当比较中剂量组和高剂量组时，在研究早期的总排泄量水平相似，但在后来的时间点上有所不同。虽然观察到几种常见的排泄模式，但个别酚类代谢物的排泄动力学各不相同（图2b-e）。表3列出了本研究中所有可定量的代谢物，按其排泄动力学分类。一半的量化代谢物在7-15d内达到最大排泄水平，然后停滞不前，在研究剩余时间内表现出一致的排泄（图2b）。最后，在中剂量组和高剂量组中，有几种代谢物表现出相似的尿液排泄水平，这表明这些化合物的产生和/或吸收在较高剂量下可能是饱和的（图2e）。为了分离蓝莓多酚的影响，所有大鼠在研究之前和之后的30 d里都保持不含多酚的饮食，这意味着所测量的代谢物的任何变化都主要是由于蓝莓酚处理造成的。在基线时，所有组均观察到可定量的酚酸和马尿酸。然而，在引入蓝莓多酚之前，没有观察到更大的酚类物质，包括类黄酮，这表明这些背景代谢物来自啮齿动物饮食中的其他来源。此外，在整个研究过程中观察到的酚类和马尿酸代谢物的巨大变化是蓝莓多酚显著改变代谢通量的直接证据。蓝莓多酚代谢物的相对和绝对量的变化如图3和表2所示，这突出了处理组之间的相似和不同。总体而言，在90 d以上的治疗组中，尿代谢物的结构相关代谢物的产生是一致的。在治疗组之间观察到的代谢通量有几个剂量依赖性的差异。如图3中的热图所示，增加蓝莓酚的剂量会导致上消化道形成更高的相对水平的代谢物，以及更完整的酚酸。相反，在低剂量组中，在代谢链中较晚形成的代谢物的相对量较大。当比较BB组和低剂量组时，他们的代谢物分布有明显的差异，表明有显著的食物基质效应。当比较GI代谢物时，这种影响最为明显，因为低剂量组比BB剂量组产生更多的酚酸II相代谢物，但产生更少的马尿酸。有趣的是，BB组的马尿酸产量与中、高剂量组没有显著差异（表2）。不同代谢物库对总酚类代谢的相对贡献因处理而异。无论进行何种治疗，低级GI来源的代谢物，特别是肠道微生物产生的代谢物的宿主异生代谢物，都有明显的优势。

图2 总酚代谢物和选定的单个酚代谢物的尿排泄动力学。（a）总酚排泄量。（b）3-羟基苯基丙酸。（c）槲皮素。（d）翠雀素葡糖醛酸苷。（e）3-羟基-4-甲氧基苯基丙酸。

表2 大鼠灌胃纯化蓝莓酚类物质或整个蓝莓后的尿酚类排泄情况

表3 所有定量代谢物的代谢物排泄定性动力学，对应于图2b-e中描述的代谢物动力学模式 

图3 酚类代谢物的代谢通量。图的上半部分显示了整个胃肠道中酚类代谢的简化模式。热图比较了各代谢产物合并液处理间的相对差异。

3 酚类代谢物的组织分布

为了评估尿酚排泄的差异是否源于组织的储存和积累，在最后一次灌胃后24小时分析了关键代谢组织中的酚类代谢物（表4）。在胃肠道组织中检测到的代谢物数量最多，因为酚类物质和胃肠道之间的广泛相互作用，以及在处死时服用酚类物质的大鼠结肠中存在变暗的食糜，这表明最终的酚类药物剂量尚未完全清除。在小肠中，共观察到12种代谢物，其中5种是可定量的。在可定量的代谢物中，各组仅观察到尿酸和硫酸阿魏酸。尽管随着剂量的增加，硫酸阿魏酸在大鼠体内的比例增加，但治疗组之间的组织浓度没有显著差异，这表明存在剂量-反应关系。其他检测到的代谢物也显示出剂量依赖关系。在结肠中，至少一个治疗组总共观察到9种代谢物，其中3种是可量化的。与小肠相似，观察到了剂量依赖性的反应，随着酚类剂量的增加，在动物体内检测到代谢物的比例更高。尽管观察到这种趋势，但在可量化的代谢物方面没有统计上的显著差异。在大脑中，观察到了三种代谢物，在所有动物中只观察到了二氢咖啡酸硫酸盐。在肝脏和肾脏中共观察到6种代谢物，其中5种在两种组织中均有发现。与胃肠道组织相似，肝和肾代谢产物呈剂量依赖关系。

表4 多酚及其代谢产物在大鼠灌胃纯化蓝莓酚类物质或整株蓝莓中的组织分布

4 酚类代谢与肠道微生物区系的相关性

根据CCA，所有代谢物都与高剂量组大鼠的菌群相关（图2）。线性相关被用来进一步确定特定微生物分类群的相对丰度与酚类代谢物之间的关系（表5）。许多通过Lefse和ANCOM鉴定为差异丰富的分类群与酚类代谢物呈正相关。有三个分类群与所有代谢物类群显著相关。除马尿酸外，有13个分类群与所有代谢物组均呈正相关，其中6个在高剂量组中含量不同。只有一个分类群与分泌的代谢物类群呈负相关。

表5 90 d时所有大鼠尿液酚类代谢物与微生物分类群相对丰度的线性相关度

在绝经后雌激素缺乏的大鼠模型中，蓝莓多酚在超过90 d时对肠道微生物群和酚代谢都有明显的剂量依赖性效应。蓝莓多酚的剂量显著改变了肠道微生物群的多样性和结构，并且微生物群落很可能随着酚类负荷的增加而向摄入酚类物质的更有效代谢转变。在高剂量组中观察到的酚类代谢物水平增加支持了这一点，特别是在研究的后期时间点。随着肠道微生物群的组成发生变化，以适应更高的酚负荷，在尿液和组织中观察到的酚代谢物也发生了变化，这可能表明某些微生物在产生某些代谢物方面更有效，或者在更高的剂量下，通常的代谢过程被淹没和饱和。如图3所示，较高剂量组中较高GI代谢物的相对丰度较好，而较低剂量组中较低GI代谢物的存在较好。这可能表明剂量增加使下消化道的代谢途径饱和，导致早期酚类代谢物的积累。由于这些早期代谢物可能存在更长的时间，它们可能会随着剂量的增加以更高的相对水平被吸收，从而产生所示的相对排泄模式。在一项人类研究中，许多测得的酚代谢物存在于基线水平，但摄入蓝莓酚会显著改变这些代谢物池中酚代谢物的总量，表明食用蓝莓后对代谢通量有显著影响。基于在90 d的过程中在高剂量中观察到的酚类代谢物的持续增加，假设高剂量的蓝莓酚类物质可能随着时间的推移导致代谢物在组织中积累。为了研究这个假设，分析了几个组织。在检测到的代谢物中，大多数在胃肠道组织中发现，这与多酚的其他研究一致。蓝莓含有大量的多酚、纤维和糖，所有这些都可以调节或被肠道微生物群利用。为了更好地理解这些食物基质因素对酚代谢和肠道微生物群的影响，使用了含有冻干全蓝莓的剂量匹配治疗组当将这两个治疗组相互比较时，观察到几个差异。尽管在低等组和高等组之间，肠道微生物的总体多样性没有统计学上的显著差异，但有一个分类单元的丰度存在差异。综上所述，结果表明，与膳食补充剂相比，食物基质对全食物的肠道微生物代谢有不同的影响。

假设增加蓝莓的剂量会在酚类代谢和肠道微生物多样性方面诱导激素反应。研究结果支持这一假设，因为蓝莓多酚在不同剂量下有不同的作用:酚类代谢以剂量依赖的方式转移，而肠道微生物多样性在中等剂量下增加，但在较高剂量下减少。肠道微生物多样性的增加与更健康的肠道微生物群有关，因此也与宿主更好的整体健康结果有关。结果表明，在中等剂量下，蓝莓多酚通过丰富肠道微生物群以剂量依赖的方式发挥作用，而在较高剂量下，它们强烈选择某些分类群。确定了几个与某些多酚代谢物显著相关的微生物物种，这可能是代谢关系的指示。特别是，与完整酚类相关的分类群可能在它们的存在下竞争很好，与其他代谢物相关的分类群可能负责导致它们产生的代谢途径。需要进一步研究特定微生物种类和酚类代谢物之间的关系，这些关系显示出剂量依赖性差异。这项研究的主要优势是，分析了酚代谢和肠道微生物群中剂量和食物基质依赖性的变化。此外，使用了比其他临床和临床前研究中使用的更高剂量的多酚来评估这些终点。使用纯化的蓝莓多酚与膳食补充剂的使用和消费直接相关。代谢产物相对和绝对数量的明显变化以及肠道微生物结构的变化凸显了剂量和食物基质的差异。本研究也有一些局限性。首先使用了一个切除卵巢的大鼠模型，该模型可能适用于也可能不适用于其他大鼠模型。第二，在每天“开灯”后不久给予灌胃剂量，这对应于大鼠的睡眠期。然而，考虑到研究的时间长度和各治疗组之间一致的给药时间，这不应混淆结果。最后，收集并分析了酚类代谢物（不是血清代谢物），以反映排泄酚代谢物的累积，这可能导致研究人员错过了一些系统递送的代谢物。

蓝莓多酚诱导剂量和食物基质依赖的酚类代谢物的产生和肠道微生物区系组成的转变。本研究证明增加蓝莓多酚的剂量会导致肠道微生物区系转变为更有效地代谢蓝莓多酚的成分。结果表明，与低剂量的整个蓝莓相比，高剂量的纯化蓝莓多酚，可以诱导肠道微生物区系的组成和酚类代谢物的产生的变化。由于肠道微生物区系的组成和循环中的生物活性酚类代谢物会影响健康结果，食用蓝莓膳食补充剂与食用整个水果可能对健康有不同的影响。