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2022 ACS SB 通过综合菌种工程策略提高枯草芽孢杆菌生产丰原素的能力

已有 486 次阅读 2024-5-13 17:57 |个人分类:生物农药|系统分类:科研笔记

原文链接:Improved Production of Fengycin in Bacillus subtilis by Integrated Strain Engineering Strategy | ACS Synthetic Biology

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Abstract

Fengycin is a lipopeptide with broad-spectrum antifungal activity. However, its low yield limits its commercial application. Therefore, we iteratively edited multiple target genes associated with fengycin synthesis by combinatorial metabolic engineering. The ability of Bacillus subtilis 168 to manufacture lipopeptides was restored, and the fengycin titer was 1.81 mg/L. Fengycin production was further increased to 174.63 mg/L after knocking out pathways associated with surfactin and bacillaene synthesis and replacing the native promoter (PppsA) with the Pveg promoter. Subsequently, fengycin levels were elevated to 258.52 mg/L by upregulating the expression of relevant genes involved in the fatty acid pathway. After blocking spore and biofilm formation, fengycin production reached 302.51 mg/L. Finally, fengycin production was increased to approximately 885.37 mg/L after adding threonine in the optimized culture medium, which was 488-fold higher compared with that of the initial strain. Integrated strain engineering provides a strategy to construct a system for improving fengycin production.

摘要

丰原素是一种具有广谱抗真菌活性的脂肽。然而,其产量低限制了它的商业应用。因此,我们通过组合代谢工程迭代编辑了多个与丰原素合成相关的靶基因。枯草芽孢杆菌 168 制造脂肽的能力得以恢复,丰原素滴度为 1.81 mg/L。在敲除与表面活性素和bacillaene合成相关的途径并用 Pveg 启动子取代原生启动子(PppsA)后,丰原素的产量进一步提高到 174.63 mg/L。随后,通过上调参与脂肪酸途径的相关基因的表达,丰原素水平升至 258.52 mg/L。在阻止孢子和生物膜形成后,丰原素的产量达到了 302.51 毫克/升。最后,在优化的培养基中添加苏氨酸后,丰原素的产量增加到约 885.37 mg/L,是初始菌株产量的 488 倍。综合菌株工程为构建提高丰原素产量的系统提供了一种策略。

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图 1. 恢复枯草芽孢杆菌生产丰原素以及敲除竞争途径对丰原素生产的影响。

(A)丰原素、表面活性素和bacillaene之间的竞争关系。

(B) B. subtilis 168、BSf01、BSf02、BSf03、BSf04 菌株的丰原素产量。

(C) B. subtilis 168、BSf01、BSf02、BSf03、BSf04 菌株表面活性素产量。*p < 0.05.

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图 2. 用不同启动子替换 PppsA 的原生启动子对重组枯草芽孢杆菌生产丰原素的影响。

(A) 不同启动子对应的 GFP 相对表达水平。

(B) 重组枯草芽孢杆菌菌株(BSf04、BSf04-1、BSf04-2、BSf04-3、BSf04-4、BSf04-5)在改良 Landy 培养基中生产的丰原素。

(C) BSf04 和 BSf04-2 菌株在 YBD 培养基中培养 96 小时后产生的丰原素。

(D) 重组枯草芽孢杆菌 BSf04-2 和 BSf04 基因 ppsA 表达水平的变化。***p < 0.001.

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图 3. 与丰原素生物合成相关的代谢途径。其中包括丰原素的前体合成,包括脂肪酸和氨基酸以及非核糖体肽合成途径。红色箭头代表基因的过度表达。实线箭头表示一步反应,虚线箭头表示多步反应。

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图 4. 脂肪酸通路调控对重组枯草芽孢杆菌丰原素产量的影响。

(A) 重组枯草芽孢杆菌的生物量(OD600)。

(B) 重组枯草芽孢杆菌的丰原素产量。**p < 0.01, ***p < 0.001

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图 5. 阻断生物膜和孢子形成对重组枯草杆菌生产丰原素的影响。

(A) 阻断生物膜和孢子形成的示意图。

(B) 单基因重组菌株 BSf04-2、BSf20、BSf21、BSf22 和 BSf23 在 YBD 培养基中发酵 96 小时后产生的丰原素

(C) 重组菌株 BSf16、BSf24、BSf25、BSf26 和 BSf27 在 YBD 培养基中发酵 96 小时后的丰原素产量。

(D) LB 固体平板上的菌落形态和摇瓶中的生物膜形态。*p < 0.05, **p < 0.01, and ***p < 0.001

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图 6. 不同培养基和外源氨基酸对重组菌株 BSf01 和 BSf26 细胞生长和丰原素产量的影响。(A) 生物量的变化。(B)丰原素产量的变化。***p < 0.001

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图 7. 不同重组枯草芽孢杆菌中的丰原素对灰霉菌和立枯丝核菌的抗真菌作用。

表1  本研究所用的质粒                                          表2  本研究所用的菌株

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