主要内容

一、研究的目的意义

二、试验材料与方法

三、结果与分析

四、结论

从植物提取的有机物包括初生代谢物和次生代谢物两大类。初生代谢物与植物生长、发育、繁殖直接相关，是植物获得能量的代谢，为植物体生存、生长、发育、繁殖提供能量和中间产物。次生代谢物是相对于初生代谢物而言，是以初生代谢的一些中间产物作为?shy;料或前体，进行进一步的代谢过程。植物的这种次生代谢产物是释放能量过程中产生的物质，与植物生长、发育、繁殖没有直接关系。但是这些次生代谢物往往具有很强的生物活性和?shy;济利用价值，是人类防治疾病的天然活性物质（即药用有效成分）或有独特?shy;济利用价值的天然产物。

人们对植物中的次生代谢产物的利用可追溯到远古时代，如香料、食品色素、化妆品、兴奋剂等，直到目前为止这些天然产物仍然在人类的生活中占有重要的位置。但从天然物质中提取的方式受到了挑战，这主要是因为：

（1）生态环境的破坏和人们对野生资源的盲目采集，造成许多野生植物趋于濒危；

（2）生态环境的差异，增加了引种和驯化的难度；

（3）可耕地面积日益减少；

（4）栽培过程的自然环境影响，使产量和质量难以控制。

另外，目前的化学合成方法由于工艺复杂，费用高，同时容易造成新的环境污染，因而发展也受到了阻?shy;。

植物细胞全能性的设想于1902年Haberlandt提出，1948年得到了证实，这为进行植物组织培养工作奠定了理论基础。自从1956年Routine和Nickel首次申请用植物组织培养生产有用次生代谢产物的专利以来，应用细胞培养生产有用的次生物质的研究取得了很大的进展。已积累了大量的资料和实验结果，并与1996年明确提出了工业生物技术的概念。

到目前为止，已?shy;有由烟草细胞培养生产磷酸二酯酶和泛醌，由紫草细胞培养生产紫草宁，人参细胞培养生产皂甙、用长春花细胞培养生产抗癌生物碱、用红豆杉细胞培养生产紫杉醇、洋地黄细胞培养生产强心甙等都达到工业化的生产规模。研究植物细胞培养过程中次生代谢物的生物合成也亦取得了进展。培养过的植物种类已超过1000多种，从培养的植物细胞中提取有用成分已超过300多种，包括10多种类别，如核酸、蛋白质、酶类、多肽、糖类、脂肪、单宁类物质、维生素、激素、各种生物碱、固醇等。

利用植物细胞培养生产次生代谢产物与利用栽培植物相比，有下列优点:

(1) 同样具有次生代谢物生物合成的全能性，但又不受地理、气候等条件的限制;

(2) 培养的细胞结构疏松，容易分散，易于固相培养和液相培养，不易污染，方便实行工业化生产，可节省土地，降低成本，缩短生产周期;

(3) 可通过细胞诱变和单细胞克隆技术，获得能够长期保持生命力和次生代谢物的合成能力的高产细胞株系，大大提高了生产效率；

(4) 可以合成某些微生物和人工不能合成的，在整体植物中含量甚微或是整株资源十分缺乏，而在培养细胞中这些成分的含量有时却很高的物种；

(5)可以在了解次生代谢过程的基础上实施对次生代谢过程的调控，包括对培养条件的调控、代谢前体物的添加及诱导子的采用，因而生产效率更高。

因此，开展旨在提高药用有效成分的细胞培养及次生代谢调控工作是一项很有应用前景的探索性研究工作，甚至可以认为这是解决各种濒于灭绝的珍稀名贵药用植物药材资源的主要途径。

由于技术上的?shy;因，仅有少数物质可用细胞培养方法来生产，主要的困难是在一些培养的组织细胞中，次生代谢产物的含量很低。但是随着培养技术的提高，已有不少培养细胞中次生代谢物的产量超过了整体植物中提取的产量。

影响植物组织培养生产次生代谢产物的因素 :

外植体的选择

高产细胞系的选择

基本培养基的筛选

培养基成分：碳源、营养元素、植物生长调节剂、附加物、pH值

培养条件

影响组织培养的环境因子主要有光照、温度、通气条件等。

杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.)是我国特有的杜仲科单属单种植物，杜仲既是很重要的特种工业?shy;料植物，也是一种名贵的药用植物，其性味甘、微辛、温、无毒，久服能轻身耐老、延年益寿，是著名的、习用的补益类抗衰老中药，具有提高机体抗缺氧耐力、提高机体免疫功能、降低血脂、平衡调节血压等功效，特别是对血压有双向调节作用，被认为是世界上最高级的降压药物.

杜仲的药用成分主要为木脂素类、环烯醚萜类、黄酮类、松脂素二糖甙、绿?shy;酸等次生代谢产物，其中松脂素二糖甙、黄酮类、绿?shy;酸等为降血压的主要成分。目前上述次生代谢产物主要从树皮中提取，但是，杜仲树生长缓慢，且剥皮对树的生长有影响。利用微生物或化学方法至今不能合成，为了更有效地保护杜仲种质资源，采用组织培养技术，在组织和细胞水平上促成杜仲有效次生代谢产物的生物合成，就可以在不受田间条件制约的情况下，进行以杜仲次生代谢产物为目的的细胞培养。

本研究探讨了基本培养基、接种方式、外植体种类、采样时间、培养条件、植物生长调节剂等因素对杜仲愈伤组织诱导、继代培养的影响以及培养基成分、培养条件等对愈伤组织中绿?shy;酸、总黄酮含量的影响，目的在于探索有效获得杜仲愈伤组织诱导及培养的方法，以及通过组织培养条件下提高其次生代谢产物含量的途径，为大规模细胞培养杜仲药用有效成分技术提供理论依据。

愈伤组织诱导供试材料为西北农林科技大学西林校区杜仲优树汇集圃4~6年生L33优树嫩茎及幼叶；种子无菌苗所用种子为市售的种子；愈伤组织继代培养试验及各因素对次生代谢产物含量试验所用愈伤组织为茎诱导出的愈伤组织第三代和第四代。

愈伤组织中次生代谢产物的提取：将收获的愈伤组织于烘箱中80℃烘至恒重，粉碎后精确称取1 g放入烧瓶中每次加入16 ml 60%酒精于80℃水浴中冷凝回流提取两次，每次1 h，抽滤，合并滤液定容至50 ml备用。

绿?shy;酸的测定：用反相高效液相色谱。

总黄酮的测定：总黄酮的测定采用硝酸铝—亚硝酸钠比色法。

计算方法为：

愈伤组织增长量=收获量/瓶-接种量/瓶

愈伤组织增长率=愈伤组织增长量?00/接种量

4.1.1几种植物生长调节剂对茎愈伤组织诱导的影响

4.1.3光照条件对愈伤组织诱导的影响

4.1.4 外植体的采样时期对愈伤组织诱导的影响

4.1.5外植体种类对愈伤组织诱导的影响

4.1.6接种方式对茎愈伤组织诱导和生长的影响

4.2.1几种植物生长调节剂对杜仲愈伤组织生长的影响

表格15 NAA和细胞分裂素组合对愈伤组织生长的影响

4.2.2不同接种量对杜仲愈伤组织生长的影响

4.2.3 不同培养基对愈伤组织生长和次生代谢产物含量的影响

4.2.4 培养时间对愈伤组织生长和次生代谢产物含量的影响(见图4)

4.2.5 光照条件和碳源对愈伤组织生长和次生代谢产物含量的影响(见图5和6)

4.2.6 继代次数对愈伤组织生长和次生代谢产物含量的影响(见图7,8,9,10)

4.2.7 培养基中矿质元素对愈伤组织生长和次生代谢产物含量的影响(见图11~18)

4.2.8 蔗糖对愈伤组织生长和次生代谢产物含量的影响见(图19)

5.1比较了MS, LS, B5, N6, H, Nitsch, White and WPM 8种基本培养基，发现MS培养基适合于杜仲幼茎愈伤组织诱导，B5培养基不仅对叶的愈伤组织诱导有利，对茎和叶愈伤组织的继代培养也比较理想的;

5.2 2,4-D、NAA和IBA三种生长素均可100%诱导出愈伤组织，以0.5 mg/L 2,4-D、0.5~1.0 mg/L NAA、1.0 mg/L IBA效果最好；2,4-D和BA及KT的组合均不利于愈伤组织诱导，低浓度的BA与NAA和IBA组合能促进愈伤组织的诱导和生长，其中1.0 mg/L NAA+0.3~0.5 mg/L BA、1.0 mg/L IBA+0.5 mg/L BA诱导出的愈伤组织生长旺盛，富有光泽，适合进一步继代培养，而高浓度则起抑制作用。

在继代培养中单独使用NAA时，以0.5mg/L效果最好。NAA与细胞分裂素配合使用时，以0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L BA的组合最有利于愈伤组织的生长，其愈伤组织生长量明显大于单独使用NAA，KT的加入对愈伤组织的诱导及生长均起抑制作用；

5.3田间材料取样幼叶以3月中旬为好，幼茎的取材时间以4月中旬以前最佳；其余时间以无菌苗的下胚轴、子叶、真叶诱导效果最好。愈伤组织的诱导和生长培养基pH值以6.3最适宜；培养室的光照条件以12 h光照、12 h暗培养有利于愈伤组织诱导；茎段的大小和接种方式以0.7cm长度横放方式诱导效果最好；

5.4系统研究了B5培养基中大量元素、微量元素、蔗糖浓度对杜仲愈伤组织生长和次生代谢产物积累的影响。实验证明：

①在1000~5000 mg/L范围内增加培养基中KNO3的含量有利于愈伤组织生长，2/3 B5培养基KNO3的浓度时绿?shy;酸和总黄酮含量及产量最高；

②（NH4）2SO4以4/3?shy;浓度时对愈伤组织生长量、总黄酮含量及产量最高，对绿?shy;酸的含量则是其为?shy;浓度的1/3时最高；

③MgSO4以2/3浓度对生长量及1/3浓度对绿?shy;酸、总黄酮积累最高；

④NaH2PO4、CaCl2和MnSO4以?shy;浓度的愈伤组织生长和次生代谢产物合成最好；

⑤ZnSO4和FeSO4的?shy;浓度愈伤组织的生长量最大，而1/3浓度的绿?shy;酸和总黄酮含量最大；

⑥蔗糖对愈伤组织生长和次生代谢产物的积累多有显著的促进作用。

5.5 糖以分析纯的蔗糖比葡萄糖和市售普通白糖更有利于愈伤组织的诱导和生长。当蔗糖浓度为40 g/L时不仅有利于愈伤组织的增长，也有利于总黄酮的积累；

《培养基成分对杜仲愈伤组织生长及次生代谢产物含量的影响》武汉植物学研究，2004, 24（4）

《培养基及培养条件对杜仲愈伤组织生长及次生代谢产物含量的影响》西北植物学报，2004, 24（10）

《杜仲愈伤组织中次生代谢产物积累动态研究》西北植物学报，2004, 24（11）

《激素对杜仲幼茎愈伤组织诱导及生长的影响》西北农林科技大学学报（自然科学版），2004, 32（1）

《不同因子对杜仲愈伤组织继代培养的研究》西北林学院学报，2004，19（1）

《杜仲组培快繁的研究》西北农林科技大学学报（自然科学版），2004, 32（6）

《杜仲愈伤组织诱导的研究》西北农林科技大学学报（自然科学版），2003, 31（5）

《不同培养基对杜仲愈伤组织诱导和生长的研究》西北林学院学报，2003，18（3）