研究表明氢气吸入对新生儿猪肺安全

研究背景/目的

氢气（H₂）吸入疗法已在新生儿缺氧缺血模型中证实具备神经保护作用，但缺氧缺血损伤后氢气对肺内皮活化、呼吸功能的影响尚不明确。本研究旨在探讨新生儿缺氧缺血损伤急性期，吸入氢气是否会加重肺内皮活化、损伤肺功能。

 方法

选取出生24 h内16头坎伯勒新生仔猪，建立缺氧缺血损伤模型，随机分为单纯缺氧缺血组（HI组，n=8）、氢气干预组（HI-H2组，n=8）；HI-H2组持续吸入2.1%~2.7%氢气6 h。采用免疫荧光检测肺组织细胞间黏附分子-1（ICAM-1）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）表达；组织学定量肺中性粒细胞数量；通过动脉血气、氧合指数、肺泡-动脉氧分压差评估肺通气换气功能；同时分析肺中性粒细胞数量与右心输出量的相关性。

 结果

与未干预组相比，氢气吸入不会升高肺ICAM-1、iNOS表达水平。尽管HI-H2组肺中性粒细胞数量显著更高，但各组动脉血气、氧合指数、肺泡-动脉氧分压差无统计学差异，肺气体交换功能未受损。肺中性粒细胞数量与右心输出量呈正相关，提示中性粒细胞增多可能源于肺灌注提升带来的细胞重新分布，而非炎症趋化募集。

 结论

新生儿缺氧缺血损伤急性期，吸入氢气可维持肺内皮稳态，且不会损害呼吸功能。肺中性粒细胞增多并未伴随内皮活化、气体交换恶化的表现，证实氢气吸入在急性期肺部应用具备安全性；同时提示肺部中性粒细胞蓄积至少部分由血流动力学重分布所致，而非损伤性炎症浸润。

Preserved Acute Pulmonary Endothelial Homeostasis with Hydrogen Gas Inhalation After Neonatal Hypoxia–Ischemia Despite Increased Neutrophil Accumulation

 1 引言

新生儿缺氧缺血性脑病是全球新生儿致残、致死的主要病因。低温治疗虽已成为标准救治方案[1]，但疗效存在局限性[2]；大量患病新生儿会合并心、肾、肺等多器官功能损伤[3]。其中呼吸损伤尤为关键：围生期窒息可致肺表面活性物质失活、肺动脉高压、炎症细胞浸润，引发气体交换障碍，患儿需长期呼吸支持[4]。

缺氧缺血（HI）损伤后，肺循环内皮活化、氧化还原失衡是核心病理机制。细胞间黏附分子-1（ICAM-1）表达上调会促进白细胞黏附、跨内皮迁移[5]；诱导型一氧化氮合酶（iNOS大量生成一氧化氮，诱发过氧亚硝基阴离子蓄积，引发亚硝化应激与内皮功能障碍[6]。此类内皮炎症活化会造成肺血管调节紊乱，是新生儿持续性肺动脉高压、窒息后换气功能受损的重要诱因[4]。

Ohsawa等人的系列研究证实氢气在体内、体外均兼具抗氧化、抗炎、抗凋亡活性，由此氢气成为极具潜力的医用治疗气体[7-9]。氢气可选择性清除羟自由基、过氧亚硝基阴离子，能够调控氧化还原相关信号通路。本团队前期在新生仔猪模型中证实：缺氧缺血损伤后吸入氢气可显著改善神经预后、提升脑血流与脑组织氧合、降低癫痫发作负荷[10-12]，提示氢气具备脑外全身保护效应。

但氢气经呼吸道直接吸入，缺氧缺血损伤后其对肺内皮稳态的影响尚不明确。氢气整体表现为抗炎物质，但缺氧缺血急性期吸入氢气是否调控ICAM-1、iNOS等肺内皮活化标志物仍无定论[13,14]。明确氢气是否抑制、至少不加重内皮炎症信号，是其临床转化安全评估的关键。

此外，本团队在同一新生仔猪模型中证实：氢气吸入可升高右心输出量，且不影响左心功能[15]，说明氢气存在血流动力学调控作用。肺灌注水平直接影响白细胞转运，心输出量改变可能独立于内皮炎症活化，改变肺部免疫细胞分布。

因此本研究核心目的：探究缺氧缺血损伤后吸入氢气是否上调ICAM-1、iNOS介导的肺内皮活化，以及早期损伤阶段是否损伤呼吸功能。研究假设：氢气不会加剧内皮炎症信号、不破坏肺气体交换；同步检测肺部中性粒细胞蓄积，并分析其与心输出量的关联，明确免疫细胞增多源于内皮损伤炎症，还是血流动力学改变。

 2 材料与方法

 2.1 实验动物

本转化医学研究采用成熟新生仔猪缺氧缺血性脑病模型，观测氢气吸入后6 h急性期肺部与全身效应。实验选用日本大和畜产坎伯勒新生仔猪16头（公10头、母6头），出生24 h内，体重1.5~2.1 kg。

本动物实验经香川大学动物伦理委员会批准（审批号15070-1），严格遵循机构动物管理规范与ARRIVE动物实验指南。

动物麻醉：空气混合1%~2%异氟烷诱导麻醉，气管插管机械通气；留置脐动、静脉导管用于补液与生命体征监测。静脉持续给予泮库溴铵（负荷0.1 mg/kg，维持0.1 mg/kg/h）肌松、枸橼芬太尼（负荷10 μg/kg，维持5 μg/kg/h）镇痛；输注2.7%葡萄糖电解质溶液，速度4 mL/kg/h；全程维持直肠温度39.0±0.5 ℃。

 2.2 造模实验流程

本研究缺氧缺血造模方案沿用本团队成熟体系，以振幅整合脑电图（aEEG）、时间分辨光谱脑血容量（CBV）双指标实时监测，精准控制损伤严重程度。

前期验证实验证实：相较于仅依靠aEEG调控，aEEG联合CBV可在保证仔猪存活的前提下，形成稳定、可重复的脑组织病理损伤；造模仔猪存活率更高、脑损伤模型重复性更好。

造模操作：吸入氧浓度（FiO₂）降至4%诱导缺氧，目标脑电图振幅＜5 μV；缺氧持续30 min，全程调整氧浓度维持脑电抑制，同时保证心率＞130次/分、平均动脉压不低于基线70%。按照标准化方案控制缺氧强度与时长，保证动物存活、避免循环衰竭。达到预设生理阈值后给予100%氧气复苏，后续调整吸氧浓度维持血氧饱和度95%~98%。

 2.3 氢气给药方案

缺氧缺血造模完成后，仔猪随机分为HI组（无干预，n=8）、HI-H2组（呼吸机持续供给2.1%~2.7%氢气，干预6 h，n=8）；采用理研TP-70D氢气检测仪实时连续监测气道氢气浓度，根据氧需求动态调整氢气配比。

 2.4 生理指标检测

分别于造模前基线、复苏即刻（0 h）、损伤后1 h/3 h/6 h采集动脉血，检测血气参数（pH、动脉血氧分压PaO₂、动脉血二氧化碳分压PaCO₂）、氧合指数（OI）、肺泡-动脉氧分压差（AaDO₂），纵向对比两组肺功能变化。

氧合指数计算公式：OI=(平均气道压×吸入氧浓度×100)/PaO₂

肺泡-动脉氧分压差计算公式：AaDO₂=[吸入氧浓度×(大气压-水蒸气压)-PaCO₂/0.8]-PaO₂

采用海平面标准数值：大气压760 mmHg，饱和水蒸气压47 mmHg。

 2.5 超声心动图检测

采用佳能Xario100S超声仪、12 MHz多频扇扫探头；胸骨长短轴切面脉冲多普勒采集左右室流出道流速，取样容积置于主动脉、肺动脉瓣上方；离线描记多普勒血流曲线，计算每搏输出量、右室流出道速度时间积分（RVOT-VTI）；心输出量=每搏输出量×心率。检测方法与本团队既往仔猪模型完全一致[15]。

心脏超声为实验方案后期补充监测项目，未改动动物总数、操作流程、人道终点；仅每组5头仔猪完成完整心脏多普勒检测，其余8头全部完成血气、组织病理检测。

 2.6 组织学与免疫荧光检测

损伤6 h后深度麻醉下处死仔猪，持续静脉芬太尼镇静、泮库溴铵肌松，气管插管维持通气，5%异氟烷吸入麻醉直至呼吸停止、确认死亡。

肺组织生理盐水灌注、4%多聚甲醛固定；石蜡切片采用PM1中性粒细胞抗体免疫组化，每张切片随机选取10个400倍高倍视野计数分叶核PM1阳性中性粒细胞。

免疫荧光操作：5 μm石蜡切片脱蜡复水，10 mM柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）煮沸5 min抗原修复；牛血清白蛋白封闭后4 ℃一抗孵育过夜：ICAM-1（1:100）、iNOS（1:100）；洗涤后荧光二抗避光孵育，Hoechst 33342染核（1:1000）。共聚焦激光显微镜统一曝光参数采集荧光图像。

定量分析：设盲研究者每张切片随机选取3个视野，ImageJ 1.54p软件统一分析；不设置信号阈值、不手动圈选区域、无背景扣除，全视野测定ICAM-1、iNOS荧光强度；Hoechst核图像统一自动二值化，阳性核面积作为内参，荧光强度标准化为“单位核面积荧光值”，取3个视野均值代表单只动物。随机设盲取样、无人工筛选图像，最大程度降低观测偏倚，未额外评估观测者信度。

 2.7 统计学分析

GraphPad Prism 9.3.1软件统计，数据以均值±标准差表示；两组重复测量数据采用双因素重复方差分析，Tukey事后检验；P＜0.05为差异具有统计学意义。本研究为探索性预实验，未开展事前样本量计算。

 3 结果

 3.1 肺组织病理与内皮标志物表达

图1为肺组织HE染色、免疫荧光典型图像。HI组与HI-H2组肺泡结构完整，无明显破坏（图1A、B）。

缺氧损伤后两组肺组织均可检测到ICAM-1、iNOS荧光表达；HI-H2组两种蛋白荧光强度与单纯HI组无显著升高（图1、图2）。

图2定量结果：ICAM-1组间P=0.61，iNOS组间P=0.40，两组无统计学差异。

 3.2 肺中性粒细胞定量

PM1免疫组化可见两组肺泡、肺间质均存在中性粒细胞；6 h取材时HI-H2组高倍视野中性粒细胞数量显著高于HI组（95%置信区间8.6~171.9，P＜0.05，图3A）。

相关性分析：右心输出量与肺中性粒细胞计数呈显著正相关（R²=0.73，P＜0.01，每组n=5），提示肺灌注升高促进中性粒细胞在肺部蓄积。

 3.3 肺气体交换功能

全程各时间点两组pH、PaO₂、PaCO₂、氧合指数、肺泡-动脉氧分压差均无统计学差异。复苏后两组pH一过性下降，随后逐步恢复；PaCO₂、PaO₂维持生理区间，OI、AaDO₂全程稳定，提示氢气干预不会破坏气体交换（图4）。

 3.4 血流动力学心输出量

损伤后6 h内各组左心输出量无显著差异；HI-H2组右心输出量呈上升趋势，损伤5 h时显著高于HI组（表1）。

 3.5 右心输出量与肺中性粒细胞相关性

损伤5 h右心输出量与肺中性粒细胞数量显著正相关（R²=0.73，95%CI 0.50~0.97，P＜0.01）。

 4 讨论

本研究证实：新生儿缺氧缺血损伤急性期吸入氢气不会上调ICAM-1、iNOS介导的肺内皮活化。尽管氢气干预组肺部中性粒细胞数量显著上升，但肺气体交换功能完全维持；中性粒细胞蓄积与右心输出量正相关，提示该现象与肺灌注提升相关，而非炎症趋化。核心结论：急性期氢气吸入可维持肺内皮稳态、不损伤呼吸功能；中性粒细胞增多不伴随内皮炎症激活、换气障碍，无急性肺损伤风险。

缺氧缺血损伤后肺内皮活化是核心病理环节：ICAM-1等黏附分子上调、iNOS大量合成一氧化氮，生成过氧亚硝基阴离子，诱发亚硝化应激、内皮功能紊乱、肺血管调节异常，最终可进展为新生儿持续性肺动脉高压、换气衰竭[4]。

本实验中氢气未升高肺ICAM-1、iNOS表达，说明急性期氢气不会加重肺循环氧化还原失衡与内皮炎症信号。氢气可特异性清除羟自由基、过氧亚硝基阴离子，有望抑制氧化还原依赖的内皮激活通路，阻断炎症级联放大[16]。

该结果与大量肺损伤模型研究一致：呼吸机相关肺损伤、脂多糖诱导肺炎模型中，氢气均可减轻肺部炎症、降低细胞因子、抑制氧化应激；同时可调控巨噬细胞极化、减轻纤维化、改善肺功能，通过Nrf2/HO-1通路抑制HMGB1释放，全面调控氧化还原炎症通路[13,14,17-19]。本实验证实全身缺氧缺血应激下，氢气不会激活肺内皮损伤通路，可维持新生儿肺内皮稳态、缓解氧化应激相关血管病变。

传统观点认为肺中性粒细胞大量浸润是炎症损伤标志，常伴随内皮活化、换气受损[4,5,20,21]；但本研究出现“中性粒细胞增多、内皮标志物无上调、肺功能正常”的分离现象，说明氢气组中性粒细胞蓄积并非内皮炎症介导的趋化浸润。既往新生缺氧缺血模型发现：损伤早期中性粒细胞主要滞留于血管内，尚未大量跨内皮进入肺实质；此阶段中性粒细胞仅停留在微血管，虽影响微循环灌注、造成组织损伤，但无广泛间质浸润[22,23]。

本研究提示中性粒细胞增多主要由血流动力学改变驱动：右心输出量升高、肺微循环血流量增加，中性粒细胞短暂黏附、重新分布，该过程不依赖炎症信号通路[20,22,24,25]。

本研究存在局限性：未开展支气管肺泡灌洗、肺泡炎症评分；未检测中性粒细胞活化标志物、炎症因子、内皮功能直接指标，无法区分中性粒细胞是滞留于微血管还是侵入肺泡腔。该现象具体分子机制仍需后续机制实验验证，目前仅能推断中性粒细胞蓄积至少源于灌注介导的细胞重分布，而非损伤性炎症浸润。关键在于：中性粒细胞升高全程未伴随内皮活化、换气功能下降，证明氢气吸入不会诱发急性肺损伤；中性粒细胞蓄积与内皮炎症完全解耦，说明氢气可调控肺部生理，不加重急性炎症损伤[24,26]。

 研究局限性

1. 属于探索性预实验，依据既往动物经验确定样本量，无事前功效计算，结论需更大规模实验验证；

2. 观测窗口仅损伤后6 h急性期，无法捕捉延迟内皮活化、后期炎症变化，氢气长期肺组织效应尚不明确；

3. 仅检测ICAM-1、iNOS两类内皮标志物，未同步检测一氧化氮产量、过氧亚硝基阴离子、氧化亚硝化应激下游指标，未评估中性粒细胞活化、肺组织损伤详细病理；

4. 心脏超声为后期补充检测，仅每组5头完整数据，相关性分析仅作探索，存在潜在选择偏倚；未直接测量肺动脉血流量、肺动脉压力。

转化价值：新生仔猪心肺生理与人新生儿高度相似，是极具临床转化价值的大动物模型。氢气拟作为新生儿缺氧缺血性脑病辅助疗法，证实其无急性肺毒性是临床应用的关键前提。但本结论仅适用于损伤后急性期，不可直接推广至远期、其他模型，仍需大量临床前实验与严谨临床试验佐证。

未来研究方向：全面检测氧化还原、炎症全景图谱，系统评估一氧化氮信号、氧化应激通路，细化中性粒细胞活化与内皮完整性检测；延长观测周期，探究迟发性炎症、长期肺损伤；直接检测肺循环血流动力学，阐明中性粒细胞重分布机制，完整验证氢气肺部安全性与治疗潜力。

 5 结论

缺氧缺血损伤后吸入氢气不会上调ICAM-1、iNOS表达，无肺内皮活化加重现象，提示损伤早期氢气可维持肺内皮稳态、不放大氧化还原介导的炎症信号。尽管肺部中性粒细胞蓄积增多，但肺气体交换全程稳定；中性粒细胞数量与右心输出量正相关，提示该蓄积至少部分为血流动力学重分布所致，而非损伤性炎症浸润（确切机制仍待阐明）。

本研究提供临床前证据：新生儿缺氧缺血损伤急性期吸入氢气具备肺部安全性；虽仍需更长随访周期的实验佐证，但氢气吸入有望成为无急性肺内皮损伤风险的新生儿缺氧缺血性脑病辅助治疗手段。

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