由肝脏脂质过度沉积引起的脂肪性肝病是一种常见的疾病，影响着全球约三分之一的成年人。有趣的是，由于脂肪组织的脂肪酸(FA)转运增加，同时极低密度脂蛋白(VLDL)分泌减少，禁食也诱导了肝脏中的脂质积累。然而，在营养剥夺期间，肝细胞如何管理这种脂质流入，以及是否可以利用这些机制来恢复脂肪变性的功能，（小编注：禁食时肝脏也会囤积脂肪，机制是脂肪组织大量释放脂肪酸运往肝脏，同时肝脏向外转运脂质的VLDL分泌变少，导致脂肪酸大量涌入肝脏，脂质运送不出去，科研人员猜想禁食状态下肝细胞应对脂质涌入有一套保护性代谢调控程序，但是这套通路尚不明确，我们也不知道能否人为激活这条通路，用来治疗病理性脂肪肝，改善受损肝功能。）目前尚不清楚。

 肝脏在调节脂质代谢中发挥核心作用，根据营养物质的可获得性交替促进脂质氧化和合成。进食后，肝脏产生的脂质被送到脂肪组织中储存。在禁食期间，储存在脂肪组织中的脂肪酸被动员到肝脏中，用于合成替代燃料。值得注意的是，在稳态中，脂质代谢在肝脏中存在空间分离；门周肝细胞主要负责脂质氧化代谢，中央静脉周围肝细胞则参与脂质合成。这些肝细胞群体如何适应在禁食和疾病期间观察到的脂质流入，仍然知之甚少。

代谢灵活性，定义为感知和响应营养物质可用性变化的能力，对于调节适应性器官反应至关重要。在肝细胞中，这种灵活性依赖于细胞器的快速结构重组，这些细胞器形成了相互连接的网络，称为代谢小室。例如，根据细胞和组织类型，线粒体-脂滴（LDs）接触的重塑有利于脂质在线粒体中的氧化或在LDs中的储存。脂滴包被蛋白5(perilipin5，PLIN5)是促进线粒体-脂滴相互作用的几种蛋白之一。它通过一个独特的羧基端区域12-14定位到LDs并招募线粒体。尽管线粒体和LDs组织在肝脏生理和疾病中被重塑，但其功能结果仍不清楚，部分原因是研究组织中的这些过程是具有挑战性的。

拓展阅读：进食-禁食周期下肝脏与脂肪组织的脂质双向转运机制

    一、进食后：肝脏合成脂质，经VLDL转运至脂肪组织储存

进食后肠道吸收大量碳水化合物，门静脉将葡萄糖输送至肝脏，胰岛素大量分泌，主导合成代谢通路，肝脏从头脂生成（DNL）激活：胰岛素上调SREBP-1c、ChREBP两大脂合成转录因子，激活乙酰辅酶A羧化酶（ACC）、脂肪酸合酶（FAS）等全套脂合成酶，将多余葡萄糖转化为饱和、不饱和脂肪酸，再酯化生成甘油三酯（TAG）。肝脏仅少量TAG留存于脂滴，绝大多数组装为极低密度脂蛋白释放入血循环。

脂质向脂肪组织转运：VLDL随血液抵达白色脂肪组织，脂肪细胞表面脂蛋白脂酶（LPL）水解VLDL中的TAG，释放游离脂肪酸，脂肪酸被脂肪细胞摄取后再次酯化，以脂滴形式长期储存；胰岛素同步上调脂肪细胞GLUT4与LPL，强化脂质捕获能力，阻断脂肪自身脂解，避免脂肪酸回流肝脏。

调控逻辑：进食状态下PPARα通路被mTOR、胰岛素抑制，肝脏β氧化与生酮程序关闭，代谢流向“糖→脂质→外周储存”，完成机体能量储备，也是餐后血脂升高的核心分子机制。

二、禁食期：脂肪动员产脂肪酸，入肝生成酮体供能

禁食后胰岛素降低、胰高血糖素上升，机体开启分解代谢。胰岛素对脂解的抑制作用解除，ATGL、HSL活化，脂肪内甘油三酯水解，释放大量游离脂肪酸入血，禁食状态肝脏约60% 脂肪酸都来自脂肪动员。循环FFA经CD36、FATP转运至肝细胞；SIRT1、AMPK抑制SREBP-1c、ChREBP，肝脏停止脂质合成与VLDL分泌。同时PPARα联合PGC-1α，激活脂肪酸β氧化与生酮关键酶，FFA在线粒体分解生成乙酰辅酶A，合成乙酰乙酸、β-羟丁酸等酮体。酮体可透过血脑屏障供给大脑，减少肌肉蛋白分解糖异生，提升机体耐饥饿能力；若脂肪动员受阻，会诱发低血糖、低酮血症。

[3]Bideyan L, Nagari R, Tontonoz P , Genes Dev. 2021 May 1;35(9-10):635-657.

1.PLIN5富集于线粒体-脂滴接触面，是二者偶联的核心支架蛋白；

2.PLIN5第155位丝氨酸磷酸化作为分子开关，调控细胞器互作稳定性；

3.PLIN5介导的线粒体-脂滴偶联可疏导肝脏脂质、减轻脂毒性；

4.稳定PLIN5依赖的细胞器互作，能够缓解高脂诱导的肝脏脂肪变性。

研究结果

1.线粒体与脂滴的拓扑分布反映肝脏脂质利用与合成的空间分区特征线粒体与脂滴的拓扑分布反映肝脏脂质利用与合空肝细胞沿着肝小叶内的肝血窦有序排列，肝小叶是肝脏的功能单位（扩展数据图1a）。包括研究人员团队在内的近期研究表明，线粒体形态、脂滴含量和脂质代谢在门脉周围-近中心的轴(PP-PC)上存在差异。研究人员绘制了单细胞分辨率下的细胞器拓扑结构，以进一步研究细胞器结构与脂质代谢之间的关系（小编注：“细胞器拓扑结构”在这里指的是线粒体和脂滴这两种细胞器在肝小叶这一三维组织空间内的排列方式、形态特征以及空间分布规律。门脉区和小叶中部肝细胞中的线粒体具有更高的球形度，相比之下，中央静脉周围肝细胞形态更呈管状，同时线粒体密度增加。门脉区的脂滴稀疏且体积小，中央静脉周围肝细胞中脂滴含量更高，面积更大）。为此，对表达线粒体靶向Dendra2(mtDendra2)的转基因小鼠肝脏切片进行BODIPY和鬼笔环肽染色，分别标记脂滴和细胞结构，获得共聚焦图像(图1a)。通过对门脉三联管内胆管进行肌动蛋白标记，确定了PP-PC轴的方向（扩展数据图1b-d）（小编注：鬼笔环肽标记的肌动蛋白会同时显示两处结构，铺满整张肝组织视野、连成细密网格的，是肝细胞之间的胆小管；而门脉三联管里的胆管只长在汇管区（PV），在整张大图里范围很小，所以肉眼看上去很难发现二者区别。不直接在图像上对比两种肌动蛋白形态，而是依靠肝脏固定的解剖特点：胆管是汇管区独有的结构，中央静脉旁边不会出现胆管。依靠胆管对应的actin信号，我们就能确定视野边缘的空腔是汇管区（PP侧起点），小叶中心的空腔是中央静脉（PC侧终点），两点相连就得到PP-PC轴。简单来说，只要在血管空腔周边找到胆管对应的管状actin信号，这个空腔就是门静脉汇管区,位于肝小叶中心、周边无胆管的空腔血管为中央静脉）。此外，Dendra2在PP区域的荧光强度始终较高，为组织定向(扩展数据图1e)提供了一个间接的标志点（扩展数据图1e）（研究先依靠actin标记胆管划定PV-CV轴线，将轴线划分为R1-R12连续区间；定量提取各区肝细胞mtDendra2荧光强度，发现荧光从PV侧（PP）向CV侧（PC）逐步降低，形成特征性梯度。该亮度梯度可以反向辅助判断 PP–PC 走向，作为空间定位的间接依据）。

研究人员使用基于Python的自定义工作流程（Python3.10版本）提取了细胞和细胞器特征，该工作流程采用了深度学习分割技术。通过计算分割后的肝细胞（图1b）到中央静脉的距离，并将其除以门静脉-中央静脉的总长度，为每个肝细胞分配了空间坐标（取值范围为0至1）（图1c）。门静脉-中央静脉轴经人工裁剪（虚线矩形）。同样地，研究人员利用scikit-image中的regionprops函数对细胞器进行分割，并测量了几何参数（如面积、密度、球形度；详见方法部分）（图1d）（小编注：regionprops是MATLAB中用于度量图像区域属性的函数，属于计算机领域的图像处理工具。全称skimage.measure.regionprops。可以将图像中的不同不同对象分离出来，自动测量每一块独立连通区域如单个细胞器、肝细胞的全套几何及物理参数）。对来自3只小鼠的18条门静脉-中央静脉轴的分析显示，轴的平均长度为250微米，每条轴包含12-16个细胞（图1e）。为保证每个区间内至少包含1个肝细胞，研究人员将门周-中央静脉轴划分为12个区段；1号区段距离汇管血管最近，12号区段最靠近中央静脉。分割区域中超过80%的检测细胞均为HNF4α阳性肝细胞（扩展数据图1f）。

研究人员沿着门脉-中央静脉轴绘制了具有代表性的线粒体和脂滴特征（补充数据图1）。门脉区和小叶中部肝细胞中的线粒体具有更高的球形度（值为1表示完美球体）和更低的密度。相比之下，中央静脉周围肝细胞（第9-12组）表现出更低的球形度，表明其形态更呈管状，同时线粒体密度增加（图1f）。门脉区（第1-3组）的脂滴稀疏且体积小。第9组之前脂滴丰度持续较低，随后第10-12组中脂滴丰度急剧增加，这反映了中央静脉周围肝细胞中脂滴含量更高（图1g）。从第3-9组开始，脂滴平均面积逐渐增大，而在中央静脉周围区域（脂滴数量最多的第10-12组）略有减小（图1g）。

为验证二维（2D）切片的测量结果能否准确反映细胞器的三维（3D）形态，研究人员还在共聚焦Z-stack图像中评估了线粒体和脂滴的特征（扩展数据图2）。研究人员使用Imaris软件手动分割单个肝细胞，并重建细胞和细胞器表面（扩展数据图2a、b）。研究人员观察到二维图像中线粒体球形度与密度呈负相关关系，这一结果在三维图像中得到了证实（扩展数据图2c）。同样，在二维和三维数据集中，脂滴特征均沿门脉-中央静脉轴呈分区分布（扩展数据图2d）。降维处理对细胞器特征无影响，二维和三维数据呈现出相似的趋势。二维和三维数据集中的细胞面积分别如图1h和扩展数据图2e所示。扩展数据图2f展示了三个独立实验中观察到的细胞器特征总结示意图。

接下来，研究人员探究拓扑特征的组合是否编码了空间特征。通过整合补充数据1中的线粒体和脂滴特征进行主成分分析（PCA），结果显示相邻肝细胞聚集在一起（图1i）(小编注：主成分分析（Principal ComponentAnalysis）是无监督降维算法，核心原理是通过‌正交线性变换‌，使数据在新坐标系下的‌方差最大化‌，第一主成分包含最多信息，后续成分依次递减且相互独立，核心作用是把大量高度相关的定量特征转化成成少数几个互不相关的主成分（PC），在尽量保留原始数据信息的前提下简化数据，用于聚类、分组、梯度趋势可视化）。每个主成分分析点代表沿门脉-中央静脉轴（R1–R12）每组或每个细胞的线粒体和脂滴平均特征。分析结果形成了三个聚类：R1–R3、R4–R10和R11–R12。聚类中包含相邻细胞可能反映了它们具有重叠的功能（图1i）。

总体而言，线粒体和脂滴的单细胞表型分析有效利用了二维数据集，实现了更快的数据采集、更大的样本量和自动化分析。这种新型单细胞表型分析方法重现了与脂质氧化、合成及储存功能二分法相关的空间特征，有望明确负责脂质代谢的肝区。

图1 脂滴与线粒体拓扑结构划分肝小叶区域

扩展数据图1 解剖标志用于指导单细胞表型组学中的组织定位

扩展数据图2 脂滴与线粒体三维结构的单细胞分析

肝小叶内血液由门静脉单向流向中央静脉，沿门静脉周（PP）—中央静脉周（PC）形成连续生理梯度，造就两类完全不同的肝细胞微环境：PP区靠近汇管，血氧分压、肠道来源游离脂肪酸、循环营养浓度最高，Wnt/β-catenin通路活性被抑制，细胞适配分解代谢；PC区位于小叶中心，经上游细胞消耗后氧气、底物大幅下降，形成低氧微环境，内皮细胞持续分泌Wnt配体，合成、解毒相关通路占主导。血氧、营养、信号三重梯度，直接决定线粒体形态、脂滴分布与脂质代谢的轴向分异规律。

线粒体形态存在清晰二元分化。借助FIB-SEM三维重构与Mito-Dendra2活体成像可见：PP肝细胞线粒体体积、总表面积约为PC的2倍，球形指数0.93，形态圆润；PC线粒体细长呈管状，球形指数仅0.74。该结构差异由线粒体裂变、融合蛋白分区调控，PP高表达裂变相关Mtfr1，PC富集融合因子MIGA2。AMPK、mTOR营养通路可动态重塑线粒体形态：激活AMPK能将PC管状线粒体转变为球形，持续mTOR信号则让PP线粒体拉长，证明细胞器形态是营养梯度的可逆适应性变化。

脂滴含量沿PP到PC逐步升高。正常饲喂条件下，PP区域脂滴数量少、体积微小；靠近中央静脉的PC区段脂滴密度、总甘油三酯含量显著上升。营养状态会重塑线粒体-脂滴接触位点：禁食时全小叶细胞器互作大幅增加，方便脂肪酸转运氧化；短期高脂饮食下仅PP形成大型脂滴，PC脂滴细小、互作稀少。脂滴调控蛋白PLIN5是核心枢纽，禁食后全小叶表达上调，其S155位点磷酸化状态决定功能：非磷酸化突变促进线粒体结合、甘油三酯储存，模拟磷酸化则减少脂滴生成，调控脂质流转。

脂质代谢功能严格分区适配微环境。PP线粒体氧化磷酸化复合物高表达，膜电位、氧气消耗速率、ATP产量远高于PC，主要依靠脂肪酸β氧化供能，成脂关键酶ACC1发生抑制性磷酸化，内源脂质合成被阻断；PC线粒体优先利用丙酮酸，柠檬酸合酶活性显著升高，大量柠檬酸转运至胞质启动从头脂合成，Fasn、Scd1等成脂酶富集。同时PC区BNIP3介导的线粒体自噬通量更高，清除脂合成过程中受损的管状线粒体，缓解脂毒性。

整体而言，PP肝细胞专职脂肪酸分解产能，PC负责脂质合成储存，线粒体-脂滴接触作为动态调控单元维持肝脏代谢弹性，该轴向分区紊乱是中央型肝脂肪变性的核心机制。

2.脂质流量增加会重新连接肝脏不同区域的细胞器回路

为探究肝脏脂质流入增加对细胞器特征的影响，研究人员将mtDendra2小鼠置于不同饮食条件下：对照饮食（CNTR）、过夜禁食（16小时）或喂食西方饮食4周。肝组织切片分别用BODIPY和鬼笔环肽染色，以标记脂滴和细胞结构，随后进行单细胞表型组学流程分析（图2a–c及补充数据1）。

禁食会因脂肪组织脂质流入增加而导致肝脏脂质积累。正如预期的那样，整个肝小叶的脂滴含量均有所上升（图2b）。尽管脂滴大小保持相对均一，但中央静脉周围肝细胞中的脂滴数量更多。门静脉周围（PP）和肝小叶中部区域的线粒体显得更长更粗（图2b，插图）。值得注意的是，长而粗的线粒体常包裹在脂滴周围，使两种细胞器之间形成广泛的接触位点（图2b，插图）。然而，每个肝细胞中仍有一部分线粒体保持球形结构，且不与脂滴相互作用（图2b，箭头所示）。

膳食脂质摄入还会导致西方饮食喂养小鼠的肝脏脂质积累。食用西方饮食4周就足以诱发单纯性脂肪变性（扩展数据图3a），且不会引起小叶炎症或肝细胞气球样变（扩展数据图3a）。为排除从头脂生成（DNL）被激活的可能性，研究人员检测了从头脂生成相关酶和转录因子的表达（扩展数据图3c）。如先前报道所示，禁食引起脂质流入增多，抑制脂质代谢相关基因的转录过程。但西方饮食饲喂4周并未改变这类基因的表达水平，这表明西方饮食喂养小鼠发生肝脂肪变性，机制为膳食脂质经酯化生成脂滴。一个例外是硬脂酰辅酶A去饱和酶1（SCD1）的表达水平（扩展数据图3c）。硬脂酰辅酶A去饱和酶1的活性对甘油三酯组装与脂滴扩张至关重要（小编注：硬脂酰辅酶A去饱和酶1（SCD1）负责把饱和脂肪酸转变为单不饱和脂肪酸。一方面，单不饱和脂肪酸更适合用来合成甘油三酯，是脂滴储存脂质的优质原料；另一方面，这类不饱和脂肪酸嵌入脂滴外层膜结构，能提升膜的流动性，让小脂滴相互融合、不断长大。一旦SCD1活性不足，单不饱和脂肪酸产量下降：甘油三酯合成原料短缺，脂滴没法正常蓄积脂质；同时脂滴膜变硬、不易融合，只能形成大量细小脂滴。多余的饱和游离脂肪酸无法被有效封存进脂滴，滞留在细胞内引发脂毒性损伤。），因此高脂饮食喂养小鼠体内Scd1基因上调，可能是机体针对脂质过量产生的适应性应答。

尽管西方饮食喂养的小鼠在整个肝小叶中均积累了脂滴，但这些脂滴的大小、数量和分布与禁食小鼠存在显著差异（对比图2b、c）。具体而言，门静脉周围和小叶中部肝细胞中的脂滴大于中央静脉周围区域的脂滴。西方饮食喂养的小鼠线粒体更呈球形，且与脂滴的相互作用减少（图2c）。总体而言，无论是通过禁食还是西方饮食导致的外源性脂质通量增加，均引发了脂滴和线粒体的特异性重塑。利用单细胞表型组学能够精确量化不同区域和饮食条件下的细胞器特征（图2d、e）。值得注意的是，大多数特征同时受到细胞空间定位和饮食干预的影响。这支持了脂滴和线粒体特征可编码小叶分区的空间形态特征这一观点，为理解细胞代谢状态提供了见解。

接下来，研究人员整合了线粒体和脂滴的拓扑特征，以评估空间特征如何响应饮食扰动而变化。将数据投影至二维主成分分析空间中可见，对照组、禁食组与西方饮食饲喂小鼠的肝细胞形成紧密聚集的簇群，表明饮食状态会影响细胞器拓扑结构（图3a）在分析中纳入第三个主成分后，各组样本的空间分布差异进一步扩大。这表明细胞器的特异性重塑依赖于细胞的空间定位和代谢状态（图3b）。研究人员采用树状图结合热图进一步分析细胞器特征所编码的信息。该方法通过无监督聚类，根据相似性对线粒体和脂滴的平均特征进行分组。所得热图显示了不同营养条件下细胞器特征的独特空间模式。对照组喂养的肝细胞大致聚为三组，与主成分分析数据一致，可能代表三个小叶区域。相比之下，禁食组和西方饮食喂养组的肝细胞至少聚为两组相邻细胞（图3c）(小编注：无监督聚类无监督聚类就是‌在没有标签的情况下，把相似的数据自动归到一组‌的技术。它不需要人工告诉电脑“这是什么”，而是让算法自己通过计算数据间的距离或相似度，发现数据内部的结构和规律。在本研究中是计算机算法只依靠样本自身全部定量特征（线粒体、脂滴面积、球形度、荧光密度、空间位置等），由数据本身的相似性自主分群)。

为探究沿门静脉-中央静脉轴（R1-R12）的单个细胞对禁食或西方饮食的应答情况，研究人员计算了皮尔逊相关系数，并以热图形式呈现成对相关性（图3d）。与对照组喂养细胞的细胞器相比，禁食组细胞器的相关系数值较低（浅紫色至深紫色），表明禁食会诱导脂滴和线粒体结构发生广泛重塑。相反，西方饮食喂养小鼠肝脏的细胞器特征与对照组饮食的相应特征具有高度相关性，说明西方饮食喂养小鼠肝脏的细胞器重塑程度较低。然而，部分门静脉周围肝细胞（R1-R3）受到西方饮食的影响，表现为与对照组相比相关系数值较低。

在我们检测的各项特征中，线粒体-脂滴接触会受到禁食与西方饮食的影响（图2）。小叶内不同区域及不同饮食条件下线粒体-脂滴接触的分布情况如图3e所示。对照组饮食中，脂滴含量较低且定位于中央静脉周围肝细胞（图1g），这与门静脉周围和小叶中部区域（R1-R8）缺乏线粒体-脂滴共定位、中央静脉周围区域共定位程度相对较低的结果一致。相反，禁食显著增加了整个小叶内的共定位，仅中央静脉周围区域的R11和R12除外。相比之下，西方饮食喂养小鼠的共定位仅适度增加，其数值与对照组饮食中央静脉周围区域的测量值相近（图3e）。禁食引起的线粒体-脂滴相互作用增强以及西方饮食喂养小鼠中这些相互作用的减弱，在整个小叶内表现得相对均匀。

图2 脂质通量增加诱导了脂滴-线粒体网络的重塑。

图3 单细胞表型组学揭示细胞状态与脂质代谢分区特征

附图扩展数据图3 短期西方饮食喂养下的肝脏脂肪变性与从头脂肪生成

3.脂质流量增加会重新连接肝脏不同区域的细胞器回路

为鉴定介导线粒体-脂滴相互作用的候选因子，研究人员进行了空间蛋白质组学分析。采用表面标志物和荧光激活细胞分选技术（FACS），从4只自由进食的对照组小鼠和4只过夜禁食的小鼠中富集门静脉周围肝细胞和中央静脉周围肝细胞。对分选后的肝细胞和未分选的总对照组样本进行基于串联质量标签（TMT）的定量质谱分析，以开展全蛋白质组检测。在鉴定出的4999种蛋白质中，对照组进食小鼠中有1865种（37%），禁食小鼠中有1734种（35%）表现出分区特异性（补充数据2）。主成分分析显示，空间分选肝细胞的聚类受到其小叶位置（PP或PC）和饮食状态（进食或禁食）的影响（扩展数据图4a）。对对照组进食或禁食肝细胞中PC与PP的蛋白质比值进行绘图分析，结果表明禁食并未影响肝细胞的分选效果（扩展数据图4b、c）。

通过火山图分析了两个肝细胞群体的空腹应答反应。（图4a）。研究人员发现门静脉周围肝细胞与中央静脉周围肝细胞在上调蛋白组和下调蛋白组中均存在大量重叠。例如，线粒体自噬受体BNIP3在PC区域富集，在禁食期间PP和PC肝细胞中均上调，这与该条件下线粒体自噬增强的现象一致。值得注意的是，超过一半的PP和PC蛋白质组在禁食后保持不变，这表明在营养应激期间，肝细胞的分区特性基本得以保留，仅部分蛋白质组发生重塑（扩展数据图4d）。通路分析显示，许多受调控的通路在PP和PC肝细胞中共有，且与线粒体功能和脂质代谢相关（扩展数据图4e）。

在自由进食对照饮食的小鼠中，许多肝脏脂质通路（总结于图4b）呈分区分布，关键酶的非均匀表达证实了这一点（图4c）。禁食状态下，整个肝小叶内的脂质通路蛋白要么上调要么下调（图4c为禁食状态下PP与PC的对比）。正如预期的那样，营养缺乏期间，参与脂肪酸（FA）和胆固醇合成的蛋白表达大幅降低。然而，参与TG合成的蛋白质是一个异常的合成代谢过程，在禁食28天期间反常地增加，这可能有利于将多余的游离FA暂时储存在脂滴中，以防止脂毒性。（小编注：过多游离饱和脂肪酸（SFA）可以导致脂毒性，因过多游离饱和脂肪酸（SFA）破坏内质网膜、线粒体膜磷脂结构，诱发内质网应激、线粒体功能损伤。还抑制线粒体脂肪酸β氧化，加剧ROS活性氧堆积，氧化应激放大损伤。同时激活炎症通路（NF-κB），招募免疫细胞，诱发小叶炎症，触发肝细胞气球样变、凋亡、铁死亡，长期可进展纤维化）此外，参与分解代谢过程（如脂肪酸脂解、氧化和酮体生成）的蛋白也被上调（图4c）。

为了阐明禁食肝脏中线粒体与脂滴接触的形成机制，研究人员检测了介导这些相互作用的相关蛋白表达。在进食状态的肝脏中，线粒体动力学和脂滴形成相关蛋白的表达呈现门静脉周围区-中央静脉周围区（PP-PC）分区特征（图4d、e，对比进食小鼠的PP和PC列），这可能与线粒体拓扑结构和脂滴含量的差异有关（图1f、g）。例如，与线粒体生物发生相关的蛋白在门静脉周围区肝细胞中高表达，这与研究人员之前发现的门静脉周围区线粒体质量更高的结果一致。禁食状态下，这些蛋白中的许多都被上调，与单细胞表型组学观察到的广泛重塑相符（图2和图3）。（小编注：单细胞表型组学（single-cellphenomics，缩写scPhenomics）是以单个完整细胞为分析对象，高通量、多维度定量全面测量其可观测的物理，化学及生物学特征的成像-计算整合技术体系，可测特征包括细胞或亚细胞大小及形态、基因及蛋白表达、空间位置、功能表型，区别于传统单细胞测序只测核酸，它聚焦可视化细胞器微观表型）值得注意的是，脂滴被膜蛋白PLIN5在禁食肝脏中上调（图4e）。事实上，对照饮食和西方饮食喂养的小鼠肝脏中PLIN5的基础水平相当，但禁食后会翻倍（图4f）。此外，内源性PLIN5在禁食小鼠中定位于线粒体-脂滴界面（扩展数据图5a）。总之，在稳态条件下（即进食小鼠），相互冲突的代谢过程在蛋白水平上呈空间分离状态；而在禁食状态下，只有必需的代谢过程被上调，并由所有肝细胞共同执行。

为了确定线粒体-脂滴相互作用是否可以在WD喂养的小鼠中被重塑，研究人员对长期高脂西方饮食饲喂小鼠进行过夜禁食处理。采用Imaris软件共定位分析定量检测二者互作水平（扩展数据图5b、c）。结果显示，禁食处理可诱导线粒体拉长，并同时提升普通禁食小鼠、高脂饮食+禁食小鼠体内线粒体与脂滴的相互作用。值得注意的是，禁食后脂滴体积增大，且高脂饮食联合禁食组小鼠体内可见尺寸更大的脂滴；该现象提示线粒体-脂滴接触位点可能介导脂质转运，促进脂质储存于脂滴中（扩展数据图5b）。尽管4周高脂西方饮食饲喂会诱发肝脏脂肪变性，但细胞器动态调控机制仍具备完整功能，且可响应禁食刺激，因此该模型适用于各类干预实验研究。

图4 禁食诱导空间分选肝细胞中肝脏蛋白质组重塑

图5 线粒体-脂滴接触促进脂滴扩张

扩展数据图4 空间分选肝细胞的比较蛋白质组学研究

扩展数据图5 禁食诱导线粒体与脂滴相互作用

4.线粒体-脂滴接触位点促进进食状态小鼠体内脂滴扩张

为探究线粒体-脂滴接触位点的功能作用，研究人员利用AAV8病毒载体在肝细胞中过表达PLIN5蛋白。将年龄匹配的小鼠分为两组，分别喂食对照饲料或西方饮食2周，随后过表达不同PLIN5突变体。具体包括野生型PLIN5（WTPLIN5）、缺失线粒体结合结构域的截短体（PLIN5CΔ（1-424）），以及两种磷酸化突变体：磷酸化缺失突变体（PLIN5-S155A）和磷酸化模拟突变体（PLIN5-S155E）。病毒感染4周后，收集肝脏组织和血清样本，用于显微镜观察和生化分析（图5a及补充图1）。

接下来，研究人员借助单细胞表型组学技术，探究PLIN5过表达对脂滴与线粒体形态的影响。图5b展示了正常对照饮食饲喂小鼠门静脉周围、肝小叶中部（M）及中央静脉周围肝细胞的代表性荧光图像，对应的完整肝小叶全景图见扩展数据图6。与空载体对照组相比，野生型PLIN5过表达仅轻微改变脂滴大小，并未改变脂滴在肝小叶内的整体分布模式。然而，野生型（WT）PLIN5的过表达对线粒体形态具有显著影响。1-6号肝细胞的圆形度指数升高（呈球形形态），而7-12号肝细胞的圆形度指数较低（呈管状；图5d，对比野生型PLIN5与空白对照组）。尽管喂食对照饮食，过表达PLIN5-S155A突变体的肝细胞在整个肝小叶中均表现出细长的线粒体，且这些线粒体与大型脂滴紧密相连。相比之下，表达PLIN5-S155E突变体的肝细胞中，脂滴数量更少、体积更小且分布更稀疏（图5c）。这些细胞中的线粒体主要呈球形，且线粒体面积减小（图5d）。截短型PLIN5CΔ（1-424）突变体（缺失线粒体结合结构域）的过表达并未影响线粒体形态，但导致整个肝小叶中形成小型脂滴，这可能是由于其对脂肪分解具有显性负效应所致。最后，在比较各PLIN5突变体促进线粒体-脂滴相互作用的能力时，PLIN5-S155A在整个肝小叶中表现出最显著的效应（图5e）。综上，这些研究结果表明，PLIN5介导的线粒体-脂滴接触位点以磷酸化依赖的方式促进脂质储存。

扩展数据图6 过表达PLIN5突变体探究体内线粒体-脂滴互作重塑过程

研究人员研究了过表达PLIN5对西方饮食喂养小鼠中线粒体与脂滴相互作用的影响。来自门脉周围、小叶中部和中央静脉周围区肝细胞的代表性图像如图6a所示（相应的全小叶图像见扩展数据图7a）。在西方饮食喂养的小鼠中过表达野生型PLIN5，显著影响了线粒体长度，这与对照饮食喂养小鼠中的观察结果相似。然而，在这些条件下，线粒体与脂滴的接触位点出现频率高于对照饮食喂养的小鼠（图6a，对比野生型和敲除型）。在表达PLIN5-S155A的肝细胞中，全小叶均观察到线粒体与脂滴的接触。相比之下，表达PLIN5-S155E的肝细胞中，线粒体呈圆形，且很少包裹脂滴（图6a）。此外，表达野生型PLIN5和PLIN5-S155E的组织中脂滴含量低于表达PLIN5-S155A的组织（扩展数据图7a）。正如预期的那样，截短突变体PLIN5CΔ（1-424）无法将线粒体募集到脂滴上。总之，在对照饮食中过表达PLIN5突变体所诱导的表型与西方饮食中的观察结果一致。此外，在对照饮食和西方饮食喂养的小鼠中，PLIN5-S155A和PLIN5-S155E突变体分别影响线粒体形态，并促进线粒体与脂滴接触的组装和拆卸（图6a、b）。

接下来，研究人员研究了在对照饮食或西方饮食喂养的小鼠中过表达PLIN5突变体对全身和肝脏生理的影响。与对照饮食喂养的小鼠相比，西方饮食喂养的小鼠体重增加。过表达PLIN5突变体对体重、血清胆固醇水平或游离脂肪酸（FFA）水平无额外影响（扩展数据图7b、d、e）。然而，西方饮食引起的血清葡萄糖水平升高在表达PLIN5-S155E突变体的小鼠中有所降低（扩展数据图7c）。西方饮食喂养的表达PLIN5-S155A的小鼠，其组织甘油三酯水平高于西方饮食喂养的敲除型对照组，这与线粒体与脂滴接触促进甘油三酯在脂滴中储存的结果一致（图6c）。相比之下，在西方饮食条件下，所有突变体的游离脂肪酸水平均接近饱和，但PLIN5-S155E从对照饮食到西方饮食的变化幅度最大，这与其较高的脂解活性一致（图6d）。这些结果支持了线粒体与脂滴相互作用促进脂质储存的假设。

PLIN5-S155A突变体中的甘油三酯积累可能源于膳食脂肪酸酯化形成脂滴，而非从头脂肪生成增加，因为脂肪生成酶的丰度（RNA和蛋白质水平）及关键调节酶的磷酸化状态均未发生改变（扩展数据图8）。西方饮食与多种PLIN5突变体的过表达及西方饮食喂养对硬脂酰辅酶A去饱和酶1水平具有累加效应（扩展数据图8a）。Scd1可将饱和脂肪酸（FAs）转化为单不饱和脂肪酸（MUFAs），这是脂滴中甘油三酯合成与储存的关键步骤。单不饱和脂肪酸还能与PLIN5协同调节氧化基因表达。尽管各突变体中Scd1的上调水平相似，但仅PLIN5-S155A突变体显示出线粒体-脂滴接触位点，且脂滴更大、甘油三酯含量更高，这支持了一种模型：线粒体-脂滴相互作用优先将过量脂质引导至甘油三酯储存途径。

西方饮食中的过量脂肪酸会引发氧化应激和膜损伤，进而导致肝细胞损伤和炎症。研究人员推测，线粒体-脂滴相互作用通过促进过量游离脂肪酸的储存来降低脂毒性。为验证这一假设，研究人员检测了烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP）/还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）水平、还原型谷胱甘肽（GSH）和丙二醛（MDA）含量。检测值经log2转换后，使用R软件中的limma包进行分析。每个检测均采用线性模型拟合，以饮食（对照饮食vs西方饮食）和PLIN5突变体为影响因素，并进行两项对比分析：（1）将西方饮食样本与对照组饮食均值对比，评估各基因突变下西方饮食产生的影响（即判断西方饮食与对照组的线性倍数变化是否不等于1）；（2）评估各基因突变中西方饮食的作用效果是否与空白组存在差异，该对比用于判断PLIN5基因突变对应的西方饮食/对照组比值是否与空白组的西方饮食/对照组比值不同。

喂食西方饮食四周后，空白对照组小鼠的脂质过氧化标志物丙二醛水平升高（图6e）。尽管所有过表达PLIN5突变体的西方饮食喂养小鼠的MDA水平均高于空白对照组，但只有PLIN5-S155A组的MDA水平较空白对照组降低，这表明线粒体与脂滴的接触可减轻脂质过氧化（图6e）。氧化还原状态指标NADP/NADPH呈现出相反的变化趋势：喂食西方饮食四周后，空白对照组、野生型组和PLIN5-S155A组的NADP/NADPH水平均降低，而PLIN5-S155E组的NADP/NADPH水平高于空白对照组，提示存在氧化性、具有潜在损伤性的环境（图6f）。最后，还原型谷胱甘肽作为一种抗氧化剂，可缓解氧化应激；PLIN5-S155E组的GSH水平较低，与更具氧化性、潜在有害的环境相符（图6g）。综上，通过将过量脂肪酸（FA）隔离到脂滴中，线粒体与脂滴的相互作用可减轻游离脂肪酸过量导致的细胞损伤。

图6 线粒体-脂滴接触促进脂质储存，缓解西方饮食诱导的脂毒性

扩展数据图7 在高脂饮食喂养小鼠中过表达PLIN5突变体

扩展数据图8 PLIN5突变体与西方饮食对从头脂肪生成的影响

为探究线粒体与脂滴的相互作用是否与长期脂质堆积相关，研究人员给mtDentra2小鼠喂食西方饮食4周、8周或12周。对肝组织切片进行标记、成像后，采用scPhenomics技术进行分析。结果显示，喂食西方饮食12周后，线粒体与脂滴的接触频率显著增加（扩展数据图9a、b）。经过12周西方饮食喂养，脂滴总表面积增大，且线粒体呈现管状形态（以圆形度降低为标志，扩展数据图9c）。然而，PLIN5基因的mRNA表达水平未发生改变（扩展数据图9d）。

在人类肝脏中也检测了线粒体-脂滴接触之间的关联。对12份健康捐赠者的肝活检样本（10名女性、2名男性）进行组织病理学分析。样本中的脂肪变性为偶发性，成因不明，反映了人群中脂肪变性的普遍发生率。根据脂质含量，将样本分为三组（图7a及补充表1）。为检测线粒体与脂滴的相互作用，对肝组织切片进行染色以标记线粒体和脂滴（图7b），捕获门静脉周围和中央静脉周围肝细胞的高分辨率z轴堆叠图像，并使用Imaris软件重建细胞及细胞器表面（图7c）。结果显示，尽管各组细胞内脂滴数量无差异（图7d），但“轻度”脂质含量组的脂滴体积分布显著更高（图7e），且细胞内线粒体与脂滴的共定位程度也更高（图7f）。尽管样本量有限，脂质含量更高的样本中PLIN5 mRNA表达水平也更高，该结果与线粒体-脂滴互作程度趋势一致（图7g）。上述结果证实：脂质含量与线粒体-脂滴相互作用存在相关性，且二者在长期高脂西方饮食干预过程中均会发生动态重塑。

综上，本研究提出假说：PLIN5的磷酸化修饰调控线粒体-脂滴接触位点形成及其维持脂质稳态的功能（图8）。非磷酸化突变体PLIN5-S155A可增多线粒体-脂滴接触，促进游离脂肪酸酯化生成甘油三酯并储存于脂滴，同时缓解氧化应激；而模拟持续磷酸化突变体PLIN5-S155E会减少二者接触，使脂滴体积缩小，细胞抗氧化能力下降。长期高脂西方饮食饲喂后，线粒体-脂滴接触位点数量显著增多，提示脂质长期过载下，这类细胞器接触位点会产生损伤效应。(小编注：线粒体-脂滴接触不存在绝对有益或有害的状态，受PLIN5磷酸化动态调控。短期西方饮食可上调PLIN5磷酸化，启动代偿机制促进脂质代谢，但此时线粒体与脂滴接触数量不足，游离脂肪酸无法充分氧化，引发早期脂毒性；禁食条件下PLIN5磷酸化水平下降，解除脂解抑制以动员脂滴供能；长期西式饮食会耗尽代偿能力，PLIN5磷酸化水平降低，线粒体-脂滴接触异常增多，过量脂质持续流入线粒体造成损伤。由此可见，线粒体-脂滴接触存在稳态区间，接触过少或过多均可诱发脂质代谢失衡；PLIN5磷酸化的动态改变，推动细胞应答从适应性代偿过渡至病理性重塑。）

图7 线粒体-脂滴接触位点与人肝脏内更高的脂质含量相关

图8 PLIN5介导的线粒体-脂滴接触调控脂质稳态

脂肪变性肝病是一种常见的慢性肝脏疾病，但肝细胞如何适应膳食脂质负荷增加仍不完全清楚。本研究采用单细胞组织成像技术和空间蛋白质组学，绘制了不同膳食状态下的脂质代谢图谱。禁食会重塑线粒体和脂滴，增加线粒体与脂滴的接触，而在西方饮食喂养的雄性小鼠中，这种接触较为罕见。禁食还会上调PLIN5——一种介导线粒体与脂滴连接的分子。PLIN5过表达以磷酸化依赖的方式调控接触形成：S155A突变体增强细胞器间接触并促进脂滴扩张，而S155E突变体则减少接触，导致脂滴数量减少、体积变小。在西方饮食喂养的小鼠中过表达S155A突变体可降低脂毒性。这些数据揭示了一种适应性细胞器相互作用程序，该程序在营养应激期间引导脂质代谢，且会被致肥胖饮食削弱。本研究建立了用于空间分辨细胞状态分析的scPhenomics技术，并证实PLIN5磷酸化是调节肝细胞脂质流动的关键节点，为靶向线粒体-脂滴偶联提供了治疗潜力。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s42255-026-01476-1

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