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文章题目：Emergence of a novel conjugative hybrid virulence multidrug-resistant plasmid in extensively drug-resistant Klebsiella pneumoniae ST15

文章链接;10.1016/j.ijantimicag.2020.105952

发表时间：2020.6

期刊：Int J Antimicrob Agents

IF：15.441

研究背景/目的：耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌（CRKp）和高毒力肺炎克雷伯菌（hvKp）通常属于不同的克隆群，它们代表了两种具有临床意义的病原体，且分别与多药耐药（MDR）医院相关感染和高毒社区获得性感染这两类问题相关。最近的研究表明，CRKp和hvKp可以通过获得碳青霉烯酶编码质粒或毒力质粒进化成CR-hvKp，可以引起严重的、不可治疗的侵袭性感染。

研究对象：肺炎克雷伯菌KP17-15、KP17-16

研究方法：药物敏感性检测、全基因组测序、接合转移、S1-PFGE等

主要研究思路及结果

1、菌株来源信息

本研究鉴定的2株K. pneumoniae于2017年11月从河南省平顶山市一家当地医院分离。KP17-15、KP17-16分别来自A患者的血液和B患者的痰液。A、B两人为室友。

2、耐药表型及基因型

MIC结果如表1所示，这两个分离株对磷霉素外的其它所有用于治疗肠杆菌科感染的测试抗菌药物均耐药，鉴定为XDR菌株。

方法：Vitek 2鉴定药物敏感性，微量肉汤稀释法和琼脂稀释法测定MIC

通过WGS获得的基因型结果显示，两者基因组高度同源，核心基因组仅有12个SNPs，且它们均属于ST15，荚膜型wzi19/K19，提示两株菌株属于同一克隆。预测结果显示两者都含有24个与表型相关的耐药基因和多种毒力基因，其中大部分由质粒介导。但未发现mcr基因或pmrA、phoPQ、mgrB基因突变，可能是其他机制如孔隙蛋白或外排泵等导致的黏菌素低水平耐药。

方法：WGS、MLST 、PlasmidFinder、ResFinder、ISfinder、VFDB、Prokka（注释）、Roary分析（核心基因、SNP）

3、ST11 K. pneumoniae毒力研究

p17-15-vir全长479,335 bp, GC含量为49.26%，包含毒力基因rmpA2和iutA -iucABCD。AbST结果显示其iuc位点属于iuc1谱系。

BLASTN显示其同源性最高的质粒p44-1覆盖率仅为55%，说明p17-15-vir是一种新型毒力MDR质粒。图1A可以看到p17-15-vir与经典的pLVPK质粒具有极大的差异，几乎只保留了rmpA2和iutA -iucABCD所在区域，但其仍具有高毒力。

图1B、C显示p17-15-vir是由毒力质粒p17-16-vir和耐药质粒p17-16-CTX 重组而成的杂交质粒，重组位点是II组内含子逆转录酶和移动元件ISShes11。该过程可能涉及三个重组事件，且根据重组位点可将2个质粒划分成四个区段（R1-R4）：R1包含接合转移系统和MDR片段；R2包含rmpA2、iutA -iucABCD的毒力保守区和耐药插入区；R3编码典型的重金属转运外排系统；R4编码质粒分配系统。杂交质粒的产生表明，插入序列和内含子介导的重组在携带MDR和毒力因子的杂交超大质粒融合中起着关键作用。

方法：BRIG、Easyfig

（图1 p17-15-vir结果和重组分析）

4、质粒的可转移性和杂交合结构

接合实验的结果（表1）显示p17-15-vir和p17-16-vir都能转移到K. pneumoniae受体菌HS1 1286YZ6中，尽管p17-16-vir并没有接合转移相关的元件，但p17-16-vir并不能转移至受体E. coli。

在更换选择药物后发现，p17-16-vir与p17-16-CTX共转移并重新融合成新的p17-15-vir样质粒。S1-PFGE、Southern杂交和WGS证明了该融合质粒的存在。如图2所示，p17-15-vir样质粒与p17-15-vir四个区段的重排方式并不一致，说明它们可能是通过不同重组途径产生的。

方法：接合转移、PCR鉴定、S1-PFGE、Southern杂交

（图2p17-15-vir样质粒与p17-15-vir四个区段的重排方式）

（图3 多重耐药毒力质粒在肺炎克雷伯菌或大肠埃希菌之间产生和转移的示意图）

文章结论

 本研究描述了一种新型MDR-毒力杂合质粒的特征和形成途径。非接合质粒在辅助质粒的帮助下转移并发生融合，II组内含子逆转录酶和移动元件ISShes11是重要的重组位点。

参考文献

Li R, Cheng J, Dong H, et al. Emergence of a novel conjugative hybrid virulence multidrug-resistant plasmid in extensively drug-resistant Klebsiella pneumoniae ST15 [J]. Int J Antimicrob Agents, 2020, 55(6): 105952.

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