氢气是氧化应激激活剂，氢气效应机制新探索

含血红素的酶可利用分子氢生成过氧化氢：对人类细胞氧化还原信号传导的意义

发布日期：2026年6月16日

M.B. 是 H2Global 集团（捷克奥斯特拉瓦）的外部顾问。 含血红素的酶可利用分子氢生成过氧化氢：对人类细胞氧化还原信号传导的意义

卢卡斯·布拉哈¹，特蕾莎·韦尔内罗娃¹，奥莱娜·斯特拉赫¹，翁德热伊·斯特尔纳德¹，雅库布·克雷伊奇²，伊瓦娜·克里佐娃³，约翰·T·汉考克⁴，米哈尔·博泰克²，托马什·鲁姆尔¹，以及雅罗斯拉夫·泽伦卡尔*

1捷克共和国布拉格化学与技术大学生物化学与微生物学系

2帕拉茨基大学奥洛穆茨体育学院，捷克奥洛穆茨

3捷克共和国布拉格化学与技术大学生物技术系

4 应用科学学院，西英格兰大学，布里斯托尔，BS16 1QY，英国*通信地址：雅罗斯拉夫·泽伦卡，jaroslav.zelenk@v cht.cz摘要/引言长期以来，分子氢（H2）在哺乳动物体内一直被视为代谢上惰性的气体，缺乏已知的酶催化剂来激活它。然而，大量研究却表明，H2能够调节细胞内的氧化还原信号传导，这一现象与目前广为接受的其清除自由基的假设相矛盾。在此，我们证明，H2可通过酶促氧还原反应促进人和小鼠细胞中过氧化氢（H2O2）的生成。这种由H2驱动的H2O2合成主要发生在微粒体组分中，并能被包括辣根过氧化物酶、细胞色素P450、过氧化氢酶乃至血红蛋白在内的纯化血红素蛋白所重现。这提示，H2的非靶向氧化作用可能是生物体内H2O2的新来源。尽管H2处理增加了H2O2的生成，但并未表现出细胞毒性，也未耗竭抗氧化能力，反而上调了对氧化还原敏感的信号标志物——核因子κB的活性以及血红素加氧酶-1的表达。因此，在需氧生物中，H2可作为血红素蛋白的电子供体，驱动显著的H2O2合成，从而作为一种具有广泛潜在意义的氧化还原信号介质发挥作用。正文

H2是许多厌氧细菌和原生生物的重要能量代谢物。这些微生物利用一种名为氢化酶的特殊金属酶，将H+转化为H2，以作为碳水化合物代谢过程中多余电子的受体；或者通过消耗H2，将其进一步转化为甲烷等物质来获取能量¹。因此，人体肠道中的厌氧微生物群每天可产生多达400毫升的H2，其中约60%会因H2分子的非极性特性而被吸收入血流²——这是因为H2分子能够轻松穿透生物膜⁵。

长期以来，由于人体蛋白质组中缺乏氢化酶，且在无催化剂条件下氢气的反应活性普遍较低，人们一直认为循环中的H₂与人体组织之间不太可能发生相互作用。然而，近期涌现的报道表明，在一些缺乏氢化酶的好氧微生物和植物中，H₂具有活跃的代谢和信号传导功能4,5。 2007年，由大田茂雄教授领导的研究人员发表了一篇具有里程碑意义的论文，证明氢气可保护人体细胞和大鼠大脑免受缺血再灌注损伤6。该研究提出的氢气作用机制是直接清除再灌注过程中释放的具有细胞毒性的羟基自由基（“OH”）。尽管这一机制后来得到了进一步完善3,7，但它引发了人们对氢气在包括人类在内的需氧生物中生理效应的广泛研究。

通过吸入富含4%氢气（略低于爆炸极限）的空气、饮用饱和氢气的水，或摄入释放氢气的物质，氢气可被输送到人体和实验动物的组织中8-10，并展现出显著的抗氧化、抗炎、细胞保护及促进代谢的作用11-14。 有趣的是，体内和体外的证据表明，H₂治疗的作用是由细胞氧化还原信号通路介导的，而这些通路通常由活性氧（ROS）水平升高所激活——这一发现与H₂被提出的抗氧化作用形成了鲜明对比。这些通路包括线粒体未折叠蛋白反应（UPRmt）¹⁵、线粒体激素效应、核因子E2相关因子2（Nrf2）及其下游靶标——血红素加氧酶-1（Hmox-1）¹⁶⁻¹⁹以及NADP依赖性代谢网络²⁰。 我们旨在通过探究H2对细胞氧化还原信号传导的作用机制，来解决这一争议。H2O2是一种重要的多效性氧化还原信号活性氧，由多种细胞酶和代谢途径自然产生21。因此，我们研究了H2是否会影响正常人成纤维细胞系MRC-5中受控的H2O2水平。我们采用了一种常见的检测方法：利用Amplex Red探针（AmpR）在细胞外添加的过氧化物酶（HRP）催化下，被从细胞中扩散出来的H2O2氧化。出乎意料的是，向反应体系中加入饱和H2的水后，细胞产生的H2O2显著增加（图1A、B，扩展数据图1A）。 H2O2外排的升高程度取决于H2浓度（图1C），且在5% H2（40 µmol·L⁻¹）条件下仍保持显著，这表明其具有重要的生理意义，尤其是在肠道（据报道，肠道内H2水平可达168 µmol·L⁻¹）和肝脏（H2水平为54 µmol·L⁻¹）22,23，以及在通常实验中采用的空气中4% H2暴露条件下（血液中H2水平为25 µmol·L⁻¹）8。此外，我们证实，H2处理还能显著提高（提高50%-250%）来自不同组织来源的多种其他细胞系中H2O2的细胞外释放通量（图1D）。 AmpR信号完全依赖于HRP的存在（扩展数据图1B），这表明H2引起的AmpR升高是由H2O2所致，而非由其他活性氧物种对探针的非特异性氧化所引起。此外，在不同浓度的HRP范围内，AmpR信号保持恒定（扩展数据图1B），说明H2的作用并非源于激活或再生未活性的HRP组分。

图1：H2对细胞内H2O2生成的影响。A）终点法检测的Amplex Red（AmpR）信号，对应于H2O2的生成；B）在存在或 absence 30% H2饱和水（蓝色）或对照水（灰色）中孵育60分钟后，以动力学模式记录的AmpR信号。实验使用了MRC-5细胞，并需加入辣根过氧化物酶（HRP）以催化AmpR探针的氧化反应。C）从MRC-5细胞扩散出的H2O2浓度依赖性（AmpR终点信号）随水中H2饱和度（体积百分比）的变化而变化。已扣除仅含HRP样品的背景信号S。D）不同细胞系在30% H2饱和水中扩散出的H2O2相对增加量（AmpR终点信号），与对照水（灰色）相比。同样已扣除仅含HRP样品的背景信号。E）AmpR检测方法及HRP血红素催化循环的示意图（黑色箭头），以及导致背景信号的AmpR/HRP自氧化过程（黄色箭头）。2荧光素是该检测方法的荧光产物。柱状图和线条代表生物学重复实验的平均值；误差棒表示标准差。样本量分别为：A，n=2（无HRP的细胞）和n=3（有HRP的细胞及有HRP的细胞）；B-D，n=3。由于测量误差，C（仅H2处理的HRP，20%）和D（H2处理的RAW264.7与无Hz的RAW 264.7）各排除了一组重复实验，因此这些条件下的样本量为n=2。采用双侧方差分析进行统计显著性检验。H2处理组与相应对照组之间的显著差异用***p<0.001、**p<0.01、*p<0.05表示；ns，不显著。C—对照水，H—H2饱和水。 H2O2的生成量还与样品中细胞的数量呈正相关（扩展数据图1C）；对于市售和实验室自制的H2饱和水，其效果类似（扩展数据图1D）。当以二氢荧光素代替AmpR作为HRP底物时，经H处理的细胞同样表现出H2O2生成量升高的现象（扩展数据图1E、F），这证实了该效应并非探针特异性所致。 AmpR检测法是生物体系中过氧化氢灵敏度和特异性最高的检测方法之一。然而，每次测量都必须严格控制，因为包括AmpR探针本身以及NAD(P)H在内的还原性化合物在HRP催化下会与分子氧（O2）反应，生成超氧阴离子（O-），随后该超氧阴离子可通过自发反应或经超氧化物歧化酶（SOD）催化歧化为H2O2，从而人为地提高检测信号（图1E）。有趣的是，即使在无细胞条件下，H2也会导致这一背景信号的升高，尽管其效应弱于有细胞存在时的情况（图1A、B）。 因此，我们假设HRP和一些细胞内酶能够以H2作为电子供体，催化O2还原生成H2O2（H2OPe）：

有几个有趣的相似之处支持这一概念：已有报道显示，在Hz和O2存在的情况下，某些细菌氢酶可产生H₂O₂²⁷,²⁸。此外，作为HRP及许多人体酶组成部分的铁卟啉，已被证实能够催化“OH和CO₂还原反应，以H2作为电子供体”⁷。最后，通过O2还原生成H₂O₂的现象也曾见于未偶联的细胞色素P450以及合成卟啉，但其电子供体为NADPH²⁹。 在无细胞条件下测得的H2OPe生成速率仅为0.1微摩尔·升⁻¹·小时⁻¹，该溶液中H2浓度为250微摩尔·升⁻¹（达到30%的H2饱和度），且HRP浓度为2毫单位·升⁻¹。然而，在密封体系中，这一速率在24小时内保持稳定且显著（图2A），因此被用作模型体系以探究其分子机制。H2OPe的生成速率与溶液中H2浓度呈线性关系（图2B），而HRP和AmpR探针的用量则已达到饱和水平（扩展数据图2A、B）。 我们采用标准的硝基蓝四唑盐测定法（扩展数据图2C、D）和细胞色素c还原试验（扩展数据图2E）对H2OPe中O⁻的活性进行了研究，但这些方法的灵敏度不足。利用更为灵敏的二氢乙啶氧化法对O₂⁻进行替代检测，结果表明，在对照组与H2样本之间，O₂⁻水平（对应于SOD敏感信号）并无显著差异（图2C，扩展数据图2F）。这说明O⁻并非H2OPe的中间产物。另一方面，在AmpR测定中加入SOD后，H2OPe的活性呈剂量依赖性地降低（图2D）。 这促使我们提出了一种受脂质过氧化机制以及血红素酶催化机制现有知识启发的H2OPe作用机制（图2E）。总体而言，酶处于静息状态时，Fe(3+)–卟啉与O2反应，生成所谓的化合物II，随后在静息状态下转化为化合物III。化合物III会被H2攻击，生成H2O2和Fe(2+)–卟啉酶，后者又从溶液中螯合O2，形成另一分子化合物III。因此，H2OPe消耗H2和O2，生成H2O2，但若无初始催化量的O2，则无法继续进行反应。 A六十六E波长（纳米）

图2：H2OPe的分子机制。A）仅含HRP时，30% H2饱和水（蓝色）与对照水（灰色）中H2O2的生成情况（AmpR动力学信号），监测时长为24小时。B）不同浓度H2饱和水与对照水之间H2O2生成量的差异（AmpR终点信号），对应于仅含HRP条件下净H2OPe的生成。C）在30% H2饱和水（蓝色）中，有无超氧化物歧化酶（SOD）的情况下，HRP释放的O2对二氢乙啶的氧化情况，与对照水（灰色）进行比较。D）SOD活性对HRP存在下净H2驱动的氧还原反应生成过氧化氢（H2OPe）的影响。E）H2OPe的拟议作用机制示意图。F）在10% H2饱和水（蓝色）或对照水（灰色）中，含HRP、黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶（XO），或两者的混合物时H2O2的生成情况（AmpR动力学信号）。G）仅含HRP与含HRP及黄嘌呤/XO时净H2OPe的比较。H）不同pH条件下HRP的净H2OPe水平。I）含EDTA时HRP的净H2OPe水平。J）含叠氮化钠时HRP的净H2OPe水平。K）不同波长光照下HRP的净H2OPe水平。L）HRP被H2O2氧化为化合物III的示意图。M）在H2O2和30% H2饱和水（蓝色）或对照水（灰色）存在下，HRP血红素吸收光谱的变化。在B、D、G-K中，已扣除相应对照样品的背景信号。柱状图和线条代表生物学重复的平均值；误差条表示标准差。样本量分别为：A、C和K，n=6；B、D、H-J，n=3；F、G，n=3（HRP和HRP、XO）及2（XO），另有说明者除外。M展示了一次代表性实验。由于测量误差，A（H）、B（H2处理20%）、H（不含H2 6.4）和J（H2处理0 mM与不含H2 100 mM）各排除了一个重复，因此这些条件下的样本量分别为5、2、2和2。统计显著性采用双侧方差分析进行评估。与相应对照组相比，差异显著性用P<0.001、P<0.01、P<0.05表示；ns，不显著。Δ表示H2处理组与相应对照组之间的差异。C—对照水，H—H2饱和水。 O2-对H2OPe启动过程的重要性也得到了以下证据的支持：在黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶产生O2-的条件下，H2OPe的生成量增加（图2F、G）；此外，在较高pH条件下，H2OPe的生成量同样增加（图2H）。此前已有报道指出，碱性pH有助于HRP31释放O2-。另外，H2OPe受到EDTA的抑制（图2I），而EDTA是已知的AmpR自氧化抑制剂，后者正是初始O2-的来源之一。所用浓度的EDTA对HRP的过氧化物酶活性并无影响（扩展数据图2G）。 此外，叠氮化钠是一种以机制为基础的血红素酶抑制剂32，包括HRP（图S2H），它能够阻断H2OPe的生成（图2J），这表明了基于血红素的催化作用至关重要。当反应在波长为400纳米的LED光源下进行时，H2OPe的生成被显著增强，该波长正对应于HRP血红素Soret带的最大吸收峰，这一现象证实了血红素激发所产生的强烈光刺激效应。而在波长为460纳米的蓝光照射下，光刺激效应则较弱，因为此时血红素的吸收效率较低；当使用波长为620纳米的红光照射时，光刺激效应几乎可以忽略不计，因为该波长已超出血红素的吸收区域（图2K）。 在化合物III状态下的HRP，其Soret带吸光度最大值可从403纳米特征性地红移至420纳米，从而与酶的静息状态区分开来。此外，如图2L33所示，高浓度的H2O2能够将HRP转化为这种状态。在没有H2O2的情况下，化合物III的含量可忽略不计；然而，当加入100微摩尔/升的H2O2后，所有HRP均转化为化合物III（图2M）。有趣的是，在溶液中，1微摩尔/升的H2O2与250微摩尔/升的H2之间存在一种协同效应，促进了化合物III的形成（图2M），这为H2OPe的作用机制以及H2的促氧化效应提供了有力支持。 H2OPe的潜在机制假定，它是一些细胞内血红素酶的非特异性副反应，与呼吸、蛋白质折叠或I相解毒等基础代谢过程中的变化无关——这些基础代谢过程同样会产生H2O2。因此，我们比较了活细胞与经甲醛固定细胞中H2OPe的强度。结果表明，固定处理确实降低了细胞的代谢活性（扩展数据图3A）和基础细胞H2O2的生成水平，但H2OPe的水平却得以保留（图3A）。 为了对H2OPe在亚细胞区室中的定位进行研究，我们采用差速离心法从小鼠肝组织和HeLa细胞中分离出了线粒体/过氧化物酶体组分、微粒体组分以及胞质组分。34H2OPe明显定位于包含内质网和质膜的微粒体组分，而在线粒体/过氧化物酶体组分和胞质组分中则未检测到H2OPe（图3B、C）。这一发现至关重要，因为所研究的所有这些区室均含有多种不同的血红素酶，包括质膜上的NADPH氧化酶、内质网中的细胞色素P450/细胞色素b、线粒体中的呼吸链复合物、溶酶体中的髓过氧化物酶以及过氧化物酶体中的过氧化氢酶。因此，H2OPe的代谢可能受到蛋白质相互作用与定位、各区室中O2-的可得性，以及不同血红素酶催化H2OPe能力的差异等因素的共同影响。 为揭示血红素蛋白在执行H2OPe反应时效率的预期多样性，我们通过将市售纯化的哺乳动物血红素酶与HRP和AmpR混合，在体外进行了测试（图3D）。髓过氧化物酶的催化循环与HRP类似，但活性位点的结构有所不同35，因此并未进一步促进H2OPe反应；而细胞色素P450和过氧化氢酶——尽管其催化机制略有差异，但均能形成化合物II30,36——明显加速了H2OPe反应。尽管髓过氧化物酶和过氧化氢酶理论上能够分解H2O2，但它们在H2OPe反应中产生的H2O2浓度却比这些酶对H2O2的米氏常数低几个数量级。另一方面，作为单电子传递体且无法形成化合物III的细胞色素c，则未表现出任何促进作用。值得注意的是，作为无主要酶活性但具备形成化合物I能力的血红素蛋白模型——血红蛋白和血红素-白蛋白复合物30——显示出显著的H2OPe效应。与此相反，当血红蛋白被氧化成高铁血红蛋白——这种形式无法形成化合物III——其对H2OPe的贡献则明显减弱。这些数据表明，H2OPe在血红素蛋白之间相对普遍，但并非普遍存在。其效率主要取决于活性位点的几何结构，而非底物特异性。 最后，我们研究了细胞对H2OPe的反应。在密封孔中利用AmpR监测活细胞释放的H2O2显示，H2OPe至少在4小时内保持稳定，未见任何细胞适应性变化（图4A）。我们还证实，H2并非H2O2的清除剂（扩展数据图3B）。通过Cell MeterTM细胞内荧光氢过氧化物传感器进行独立测定发现，当培养基中添加250 µmol·L⁻¹ H2时，细胞内H2O2水平比对照组高出2.5倍（图4B、C）。与AmpR检测相比，这一方法为细胞内测定，无需依赖HRP的存在，可在完整培养基中进行，且所处的氧分压更低——这正是贴壁细胞培养中自然存在的氧分压水平37。此外，即使采用AmpR方法，在含5% O2的低氧箱中以细胞悬液进行测定（该条件相当于组织中的氧水平），仍可检测到较低但依然显著的H2OPe（扩展数据图3C），进一步印证了H2OPe的生理相关性，并引发了一个问题：H2OPe是否具有毒性效应？ 将细胞在密闭孔中暴露于H₂（浓度高达250 µmol·L⁻¹）24小时，经鲁米诺代谢活性测定显示，未见任何细胞毒性的迹象（图4D）。此外，通过氧自由基吸收能力测定的细胞匀浆总抗氧化能力并未因H₂暴露而受到影响（图4E），这表明H₂O₂水平升高并未引发氧化应激。

图3 H2OPe in cell fractions and isolated proteins. A) H2O2 production (AmpR endpoint signal)

from MRC-5 cells and RAW 264.7 cells in the 30% H2-saturated water (blue) compared to control water

(grey) in live cells versus cells fixed with formaldehyde. The background signal from HRP-only was

subtracted. B) Difference in net H2OPe between 30% H2-saturated water and control water in organellar

fractions prepared from mouse liver tissue or C) HeLa cells. The background signals from HRP-only and

corresponding control samples were subtracted, and signals were normalized to protein (µg). D) Net

H2OPe in purified heme-proteins mixed 1:1 (molar) with HRP compared to HRP only. The background

signal from corresponding control samples was subtracted. Bars represent means of biological

replicates; error bars indicate s.d. Sample sizes were: AñC, n =3; D, n = 6 (HRP only) 3 (heme-proteins),

unless otherwise indicated. Owing to a measurement error, one replicate was excluded from A (H2-free

HRP only, H2-free live RAW 264.7 and H2-treated live RAW 264.7) and B (H2-treated HRP only in

microsomes measurement and H2-free Microsomes), resulting in n = 2 for these conditions. Statistical

significance was assessed using a two-sided ANOVA. Significant difference between H2-treated and

control group in AñC is indicated by ***P < 0.001; ns, not significant. Significant difference compared

to HRP only in D is indicated by **P < 0.01, *P < 0.05; ns, not significant. Δ denotes the difference

between H2-treated and corresponding control group. C ñ control water, H ñ H2-saturated water, MPO

ñ myeloperoxidase, Cyt c ñ cytochrome c, MetHB ñ methemoglobin, CAT catalase, CYP4F3B ñ

Cytochrome P450, Hb ñ hemoglobin, Heme-ALB ñ hemalbumin

另一方面，H2O2通过H2O产生的细胞内浓度升高足以激活两种典型的氧化还原信号标志物38：核因子κB的转录活性（图4F）以及血红素加氧酶-1的表达（图4G）。因此，细胞内H2O2水平的轻度升高可能解释了氢气治疗所报道的大部分效应，包括通过上调线粒体未折叠蛋白反应（UPRmt）、线粒体激素效应、转录因子Nrf2以及其他氧化还原敏感信号通路，实现对线粒体代谢的激活、抗氧化、抗炎和细胞保护作用6,8-13,15-20,39。尽管如此，这一新发现的机制可能与已报道或提出的其他氢气作用机制并行发挥作用，这些机制包括直接清除活性氧3,6,7、惰性气体对蛋白质构象的影响40、靶向线粒体中的Rieske铁硫蛋白15，以及抑制线粒体复合物I中O₂²⁻的生成41。总之，我们的研究揭示了H2在哺乳动物细胞中一种出人意料的促氧化功能。与清除活性氧（ROS）的常规作用不同，H2在多种人源和鼠源细胞系中持续增强了过氧化氢（H2O2）的生成。这一效应在含有血红素酶的无细胞体系中同样得以重现，包括辣根过氧化物酶（HRP）、细胞色素P450、过氧化氢酶和血红蛋白等，表明H2可作为电子供体，促进酶催化氧气还原生成H2O2。该反应主要定位于微粒体组分，并且即使在代谢失活的细胞中仍可检测到，这提示其并非由正常氧化代谢的调节所介导，而是直接通过酶的活性位点实现的。尽管H2O2的生成水平升高，但暴露于H2并未表现出细胞毒性，也未损害细胞的整体抗氧化能力。相反，H2触发了适应性氧化还原信号转导反应，包括NFκB的激活以及血红素加氧酶-1的诱导。这些发现重新定义了H2的氧化还原功能，证明它能够作为一种温和的促氧化剂，通过生成H2O2来调控生理信号通路。

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