非编码核糖核酸（RNAs）是调控动、植物生长发育及环境适应性方面的关键调控元件。作为关键的非编码RNAs，microRNAs (miRNAs) 通过RISC复合体（RNA induced silencing complexes）诱导靶标mRNA降解以及抑制蛋白翻译等转录后基因沉默（PTGS）途径调控靶基因表达，广泛参与调控细胞增殖、分化、凋亡、迁移、免疫应答、应激反应和代谢等多种生命活动【1-3】。经典的动物miRNA加工过程中，由RNase III核酸内切酶DROSHA及双链RNA（dsRNA）结合蛋白DGCR8组成的microprocessor在细胞核内识别pri-miRNAs及其序列结构特征（如UG 及CNNC motifs等），在距离茎环结构约11 个核苷酸（nt）的位置剪切产生约65 nt长度且在3’末端有两个核苷酸凸出的pre-miRNA。后者运输到细胞质中并在dsRNA结合蛋白TRBP协同作用下，经由另一种RNase III 核酸内切酶 DICER精准剪切加工形成成熟的miRNAs【4,5】。与之不同，植物miRNAs主要由RNase III核酸内切酶DCL1（Dicer-like 1）通过对具有发卡结构的pri-miRNAs前体在细胞核内剪切加工而成。锌指蛋白SE（Serrate）及dsRNA结合蛋白HYL1（hyponastic leaves 1）则参与调控miRNA剪切加工准确性和效率。

相较而言，植物pri-miRNAs 结构更为复杂多样且剪切过程均由DCL1在细胞核催化完成，这种瞬时及连续的剪切加工过程使得研究者难以精确捕捉体内条件下pri-miRNAs初始切割位点及真实的剪切加工模式，导致解析植物pri-miRNAs加工过程更为困难。前期研究工作中，研究者对于植物pri-miRNAs 的剪切模式及其结构规则进行了探究，发现植物pri-miRNAs 的初始剪切位点通常发生在距单链RNA-双链RNA衔接处或内部不配对区域（internal loops/bulges）约15-17nt处（15-17nt分子尺），且pri-miRNAs二级结构对于miRNAs剪切加工效率具有关键调控作用【6-9】。然而，多数植物pri-miRNAs并不具有此类参考位点且其剪切模式也存在多样性，而基于预测推论出的绝大部分pri-miRNAs剪切加工模式真实性仍有待商榷。另一方面，现有的 pri-miRNAs二级结构数据主要是根据RNA序列固有的最小自由能预测而得，其在生理条件下真实的RNA二级结构 (RSS) 仍不清楚，而SE及HYL1调控体内pri-miRNAs二级结构及其精准剪切加工的功能仍有待厘清。

早期研究中，该团队对植物pri-miRNA剪切加工机制进行了解析，发现DCL1 RNase III结构域中的1507和1696位E残基对其发挥剪切活性至关重要。E1507Q和E1696Q是半活性的 DCL1突变体，它们仅参与切割pri-miRNAs双链中的一条链，产生部分加工的pri-miRNAs中间体【9】。本研究工作中，研究人员构建了具有部分DCL1内切酶活性的显性负突变体DCL1E1507Q和DCL1E1696Q，该突变体表现出DCL1功能缺失的发育表型，仅可对pri-miRNAs进行部分剪切。因此为精确捕捉pri-miRNAs初始切割位点创造了条件，以此判断相应的剪切模式和鉴定出真正pri-miRNAs。该遗传材料是本课题坚实的理论基础及创新点所在。利用上述材料，研究者首先通过Degradome-seq鉴定出147个真正的DCL1底物，这一数量相比于miRBase数据库先前注释的326个pri-miRNAs，极大程度勘正了限于测序技术及合适遗传材料而不确定的结论。有意思的是，该研究发现81个pri-miRNAs 剪切并不依赖于DCL1，此外，仍有98个pri-miRNAs的真实性有待进一步研究。基于降解组测序捕获的初始切割位点，研究者将147个依赖于DCL1剪切的pri-miRNAs的剪切模式系统分类整理为五种，包括基部到环（BTL，37个）、连续的基部到环（SBTL, 16个）、环到基部（LTB, 38个）、连续的环到基部（SLTB, 13个）和双向剪切模式（bidirectional, 43个）。上述研究结果不仅验证了早期注释的52个pri-miRNAs (35%) 的剪切模式，并重新注释和报道了95个pri-miRNAs (65%) 的剪切模式，为该领域后续的研究提供了极大的便利和参考价值。

同时，该研究通过优化的硫酸二甲酯突变分析与测序 (DMS-MaPseq)【10】技术系统地检测了野生型及dcl1，se和hyl1突变体中的pri-miRNAs二级结构图谱。通过对活体材料中可检测到的73个pri-miRNAs二级结构进行解析，发现其中约95%的pri-miRNAs二级结构与计算机模拟预测结构均存在不同程度差异。上述植物全基因组pri-miRNA二级结构图谱清晰地阐明了困扰科学家们的关于pri-miRNA 的初始切割位点及其剪切模式问题，表明除经典的衡量切割位点的15-17nt分子尺之外，部分pri-miRNAs广泛存在距离初始切割位点约9-11 nt的internal loops/bulges，其可能是DCL1 识别并精准剪切pri-miRNA新的参照位点。在此基础上，本研究还发现DCL1倾向于在pri-miRNA不配对的区域进行初始切割，且SE和 HYL1可单独或协同作用调控pri-miRNA精准剪切及其二级结构。整体而言，该研究通过Degradome-seq和DMS-MaPseq联合分析，提供了全基因组水平植物体内pri-miRNAs精准剪切加工及体内二级结构图谱，勘正了此前由于遗传材料和测序策略的限制而得到的一些不确切的结论，为解析植物miRNA合成机制提供了新的思路。

植物全基因组pri-miRNA精准剪切加工及二级结构图谱

德州农工大学农业与生命科学学院博士研究生严星星和博士后李长昊为论文共同第一作者，张秀任教授为论文通讯作者。海南大学刘开业教授，合肥工业大学曹树青教授及德州农工大学Peng Xu教授和James J. Cai教授等为本工作提供了重要的指导和帮助。该研究得到了美国NIH (NO. R35GM151976)，NSF MCB (NO. 2139857)及Welch Foundation (NO. A-2177-20230405) 等项目的资助。

张秀任教授团队主要从事RNA生物学相关工作，在植物非编码RNA合成及表观遗传沉默机制、RNA二级结构形成以及病毒-宿主互作等研究领域取得了系列突破性成果。张秀任教授任德州农工大学Chancellor EDGES, Presidential Impact Fellow, Christine Richardson Endowed 教授，主持多项NSF（包括杰出研究者基金）及NIH R01 和R35科研项目并长期担任美国国立卫生院(NIH), 美国国家自然科学基金委(NSF)评审委员会成员，担任多个国际顶级期刊审稿人。该团队目前已开放多个职位，欢迎感兴趣的博士后和研究生申请加入。

相关论文信息：

https://www.nature.com/articles/s41477-024-01725-9

参考文献

编辑 |余 荷

排版| 王大雪

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