一、研究背景

豆科植物与根瘤菌之间的有效共生在很大程度上依赖于植物-根瘤菌界面上不同的蛋白质在共生固氮过程中进行物质运输和信号转导。根瘤菌感染豆科植物后被宿主细胞的质膜（plasma membrane，PM）包裹形成一个特殊的细胞器—共生体。共生体由来源于宿主细胞的类菌体周膜（PBM）或、类菌体周隙（PBS）和类菌体组成。

共生体膜（SM）是维持植物细胞和根瘤菌中特定微环境稳态的关键屏障，参与物质交换和信号交流。以往的研究表明，宿主细胞内陷的质膜以及潜在的内质网（ER）和高尔基体参与SM的构建，但关于SM起源的其他方面仍不清楚。为系统了解固氮类菌体与宿主细胞在共生过程中的生物相互作用和调控，该研究利用Label Free定量蛋白质组学技术，检测了大豆SM、PBS和RMF（根微粒体部分）的综合蛋白质组图谱。

二、研究结果

1.共生体膜、类菌体周隙和根微粒体部分的分离为了更全面地了解固氮过程中固氮类菌体与宿主细胞质膜界面上的蛋白质，该研究对大豆（谷氨酸最大值）中分离得到的SM和PBS以及作为参照的RMF进行了定量蛋白质组学分析。收集接种后30天（DPI）的大豆根瘤，提取共生菌后，对于每个样品，进行3次重复。每个组分3个生物学重复的蛋白样品进行LC-MS/MS分析。对至少2个生物学重复中被至少2个唯一肽段鉴定到的蛋白进行计数，并进行进一步的统计分析。从SM组分中共鉴定得到1759种大豆蛋白和204种根瘤菌蛋白；从PBS组分中鉴定得到1476种大豆蛋白和369种根瘤菌蛋白；从RMF组分中鉴定得到2723个大豆蛋白。

图1  大豆共生体和根内膜蛋白的定量蛋白质组学分析 A：Venn图。B：Western blot分析Percoll梯度之间的蛋白称为上层蛋白，该层应包含小型共生体和游离类菌体。而60 %和80 % Percoll梯度之间的蛋白被认为含有大的共生体，并被用于进一步的SM蛋白分离。C：层次聚类。

2.蛋白功能分类揭示了SM中增强和抑制的通路除氨基酸代谢和营养摄取外，RMF中涉及的所有类别的总蛋白质数量均大于SM（图2A）。相比之下，蛋白质生物合成、蛋白质修饰、RNA加工和细胞壁类别在SM中都下调（图2A）。在SM蛋白质组中仍检测到一些胼胝糖合酶，但在SM中没有纤维素或半纤维素合酶（图2B）。植物激素途径分析表明，与RMF相比，SM中被注释到油菜素甾醇（BR）和乙烯信号类别的蛋白较少，而SM中被注释到茉莉酸（JA）信号成分超过RMF（图2C）。然而，BR和JA在共生固氮中的功能仍有争议，研究表明结节数和氮酶活性的结果相互矛盾，不同的处理条件和使用不同的豆科植物物种可能会影响结果，仍需要进一步研究以阐明成熟结节中这些植物激素的分子功能。该研究还通过层次聚类进一步分析了每个功能基团的常见SM和RMF蛋白的蛋白质水平。与RMF相比，SM中氨基酸代谢和营养摄取的蛋白质更多，而涉及蛋白质生物合成、蛋白质修饰、囊泡运输、细胞壁和植物激素的蛋白质则相反（图2D）。层次聚类结果显示蛋白质富集模式与图2A有些相似。SM蛋白质组中，参与囊泡运输的蛋白质水平较低，表明SM在囊泡运输方面不如根内膜系统活跃。同样，与根内膜系统相比，植物激素信号传导在成熟共生体中的活性也可能较低。

图2 SM和RMF大豆蛋白的功能分类和比较。A：MapMan根据蛋白质序列的相似性对蛋白质组进行功能分类注释。绿色和粉色分别代表常见蛋白质和特异蛋白质。长度表示蛋白质数量。B：对功能亚类进行分组，并根据蛋白质数量进行比较。C：对参与不同植物激素途径的蛋白质进行分组和比较。D：SM和RMF之间蛋白质丰度的层次聚类分析，按MapMan生物学过程分组。功能子类别列在主要类别下面。结果显示，某些组的SM和RMF之间的蛋白质水平存在显著差异。空白数据用灰色标记。

3. 参与共生固氮的潜在关键SM蛋白

火山图表明SM和RMF之间存在显着差异的单个蛋白质（图3A）。结果分析表明，许多潜在的转运蛋白在SM蛋白质组中上调，例如线粒体载体、硫酸盐转运蛋白、二羧酸转运蛋白1、核苷酸转运蛋白1、Glc-6-p易位子1和PMH-ATP酶11。RMF富含的蛋白质包括许多核糖体蛋白，膜联蛋白，液泡膜水通道蛋白和PM内在蛋白等。该研究结合植物体RNA-seq数据重新分析了SM和RMF蛋白质组学数据（图3B）。一些基因在RNA-seq数据中没有显示在根中表达，但在RMF蛋白质组中检测到蛋白质产物，并分别显示在散点图上方（图3B）。SM中富集的几种蛋白质在结节中也高度表达，值得进一步研究。有30种蛋白质显示出结节特异性表达和SM特异性mRNA表达，例如液泡铁离子转运蛋白（VIT）家族和氨基酸转运蛋白1，表明这些蛋白在共生固氮过程存在特殊的功能。

图3 共生固氮关键蛋白的鉴定。A：火山图显示SM和RMF之间蛋白质丰度的比较。红点和绿点分别代表SM和RMF中差异水平显著的蛋白质（FC≥2；P<0.05，T检验）；黑点表示差异水平不显著的蛋白质；紫点表示SM至RMF中显著较高或较低的转运蛋白和通道蛋白。B：SM和RMF中的常见蛋白。

3. 参与共生固氮的潜在关键SM蛋白

在SM蛋白质组中检测到几种COPI、TRAPPC和Rab GTPase蛋白，表明COPI囊泡运输可能从SM起始和脱离（图4A）。网络中晚期内体标记蛋白Rab7p参与SM生物发生和维持。在SM蛋白质组中，三种谷氨酰胺合成酶（GS）蛋白特异性表达；与RMF相比，具有另一种GS蛋白的两种GOGAT蛋白在SM中显著富集，证明了SM高效的铵盐同化机制（图4 B）。V型ATP酶和P型ATP酶亚基均存在于SM蛋白质组中，但相对于根内膜系统，其丰度较低。SM的V型ATP酶可能有助于调节pH稳态，建立SM电化学梯度，从而驱动营养物质跨膜运输（图4C）。

图4 SM大豆蛋白的次级网络分析，以及共生界面中大豆蛋白结构域和根瘤菌蛋白家族的富集分析。A–C：COPI包被的囊泡运输的蛋白质网络（A）、氨同化（B）和V-ATP酶亚基（C）。节点颜色表示SM和RMF的相对蛋白质倍数变化（P < 0.05，T检验）。SM特异性蛋白质以黑色标记。D和E：由Pfam在SM中预测的大豆功能结构域富集的词云摘要（D）和由COGs在PBS中分类的根瘤菌蛋白家族富集（E）。

4. 功能结构域和蛋白质的富集分析表明共生界面的不同特征

SM蛋白质组中其他的转运蛋白，如线粒体载体蛋白、ABC转运蛋白、E1-E2 ATP酶或P型ATP酶和阳离子转运蛋白（图4D），表明SM物质交换中起重要作用。以上结果表明，SM蛋白质组中存在各种亚细胞定位的线粒体载体蛋白。蛋白激酶结构域表明宿主细胞和类菌体之间通过SM进行潜在的信号转导。

周质结合蛋白（PBPs）是PBS蛋白质组中最丰富的日本文昌鱼（Bj）蛋白（图4 E），其位于自由生活细菌的外膜和胞质膜之间的周质空间。革兰氏阴性菌的PBPs介导溶质吸收，包括碳水化合物、氨基酸和离子。结果表明PBS也可能含有来自类菌体周质的蛋白质，参与有效的溶质摄取。

三、结论

通过定量蛋白质组学技术，该研究在SM中鉴定了1000多种蛋白质，系统地揭示了共生膜的特征。定量比较分析结果表明，与RMF相比，SM中的氨基酸代谢和营养吸收功能更活跃，而囊泡运输、蛋白质代谢和植物激素信号传导等其他功能则不太活跃，表明固氮同化中的关键途径。

蛋白质组学分析表明，SM中包含被预测定位在PM、液泡、高尔基体、TGN、ER甚至线粒体中的蛋白质，支持SM的复杂多重起源；PBS中分泌蛋白和SM中类受体激酶蛋白的鉴定为共生体可能的胞外特性以及共生界面上两种共生体之间潜在的信号交流提供了证据。该研究提供了共生界面上蛋白质机制的全面视图，并确定了可能对共生固氮至关重要的蛋白质。

编辑：PS.H

审核：Tao Li

参考文献：

Luo Y, Liu W, Sun J, Zhang ZR, Yang WC. Quantitative proteomics reveals key pathways in the symbiotic interface and the likely extracellular property of soybean symbiosome. J Genet Genomics. 2023 Jan;50(1):7-19.