CRISPR系统是一种存在于原核生物中的适应性免疫系统，用于抵御外来DNA的入侵。在长期的免疫防御斗争中，CRISPR系统已经演化成多种类型，其中，Cas9通过引导RNA（gRNA）切割外源DNA的特性被广泛研究和应用到基因编辑领域。Cas9系统具有多种亚型，如II-A、II-B和II-C，其中II-C型的Cas9的多样性最高。然而CRISPR-Cas9系统是否存在额外的机制以对抗病毒的免疫逃逸竞争尚且未知。

北京时间2024年5月29日23时，清华大学生命学院刘俊杰课题组联合北京大学生命学院白洋课题组和清华大学生命学院陈春来课题组在Nature杂志在线发表了题为“Pro-CRISPR PcrIIC1-associated Cas9 system for enhanced bacterial immunity”的研究论文。

研究团队通过大规模结构预测揭示了II-C型Cas9蛋白从紧凑型到大型的进化轨迹并鉴定出一类新型关联基因（Novel-associated genes, NAGs）。其中一种新型关联基因编码的PcrIIC1作为一种CRISPR免疫增效子（pro-CRISPR），与大型CbCas9形成异源四聚体功能性复合物，通过二聚化CbCas9显著增强其活性，最终提高了细菌的免疫力。

通过生物信息学分析，研究团队观察到一类新型关联基因（Novel-associated genes, NAGs），显著富集存在于在较大蛋白体积的II-C型Cas9的基因簇中，并推测这些NAGs可能参与到Cas9介导的细菌免疫过程中。

图1. 新型关联基因的基因簇位置（左）以及Cas9蛋白体积相关性（右）

为了进一步探索Cas9和NAGs的关系，研究人员开发了一套结构生长轨迹分析方法（structural growth trajectory analysis, SGT analysis），通过预测1381个II-C型Cas9的蛋白结构，实现了对Cas9蛋白结构演变的量化和轨迹分析。通过分析，发现了较大蛋白体积的II-C型Cas9存在自身新功能结构域生长进化的趋势，呈现出三条不同的蛋白体积逐渐变大的进化轨迹。并且研究人员还发现与NAGs的协同作用富集在三条生长轨迹的终点，这可能说明在漫长的进化过程中，Cas9系统新功能结构域的插入和NAGs的出现具有一定的相关性。

图2. 结构生长轨迹分析方法（左）和II-C型Cas9的生长轨迹图（右）

随后研究团队通过生化实验和冷冻电镜解析复合体结构表明，来自金黄色细菌属（Chryseobacterium sp.）的CbCas9生长出了一个全新的增强Cas9活性的β-REC2结构域，以及一个全新的能够与其关联基因PcrIIC1互作的CTH结构域。通过蛋白间相互作用，2个CbCas9蛋白和2个PcrIIC1蛋白能够形成异源四聚体复合物。

图3. CbCas9效应蛋白结构（左）和CbCas9-PcrIIC1复合体结构（右）

研究团队发现，PcrIIC1蛋白能够作为一种CRISPR免疫增效子（Pro-CRISPR），通过与CbCas9形成异源四聚体复合体增强其活性。CbCas9-PcrIIC1复合物表现出增强的DNA结合和切割活性，更广泛的前间隔序列邻近基序（PAM）兼容性，更强的DNA双链解旋能力以及对靶向序列互补错配（mismatch）的容忍能力。

图4. PcrIIC1增强CbCas9的DNA结合（a）、切割（b）、PAM兼容性（c）、DNA解旋（d）和错配容忍（e）能力

为了进一步探究PcrIIC1增强Cas9活性的具体机制，研究人员利用冷冻电镜解析高分辨结构发现，CbCas9-PcrIIC1复合物的能力增强来源于复合物中的两个CbCas9能够结合同一条长链DNA，通过更强的电荷相互作用，使得该复合物的DNA结合能力增强。并且，复合体中的两个CbCas9通过协同作用，使得长链DNA发生扭曲和变构，更容易被解旋，从而促进了CbCas9-PcrIIC1复合物的DNA干扰（interference）能力。同时，研究团队还发现，两个CbCas9能够对称地分别靶向长链DNA的两条单链上的靶标序列，从而提高其在基因组上搜寻靶标的效率。

图5. CbCas9-PcrIIC1复合物结合长链DNA的结构

最终，为了检验CRISPR免疫增效子PcrIIC1对CbCas9抗噬菌体免疫能力的影响，研究人员在大肠杆菌中进行了抗噬菌体实验。实验显示，与单独的CbCas9相比，PcrIIC1的协助显著减小了噬菌斑面积，表明CRISPR免疫得到了增强。而如果破坏CbCas9与PcrIIC1的相互作用，会导致增强的免疫力丧失，证实了CbCas9-PcrIIC1复合体的组装对增强CRISPR免疫至关重要。此外，PcrIIC1能够提高CbCas9对错配的容忍度，使其能够有效对抗携带靶位点基因组突变的入侵噬菌体。

图6. PcrIIC1显著增强了CbCas9系统的细菌免疫活性

总的来说，研究团队首次通过大规模结构预测揭示了II-C型Cas9蛋白从紧凑型到大型的进化轨迹并鉴定出NAGs。NAGs仅在II-C型基因簇上被发现，并且主要与分子量较大的Cas9蛋白偶联。特别是，其中一种新型关联基因编码的PcrIIC1作为一种CRISPR免疫增效子（pro-CRISPR），与CbCas9形成异源四聚体功能性复合物，通过二聚化CbCas9显著增强其对DNA底物的识别、靶向和切割的能力，最终提高了细菌对噬菌体的免疫力。

清华大学生命学院刘俊杰副教授、北京大学生命学院白洋研究员和清华大学生命学院陈春来副教授为该文通讯作者；清华大学生命学院博士后张寿悦、博士生孙奥、中国科学院遗传与发育生物学研究所博士生钱景美和清华大学生命学院博士生林铄为该文共同第一作者。

此外，该项研究工作得到了中国科学院遗传与发育生物学研究所高彩霞课题组、北京生命科学研究所董梦秋课题组的大力支持。该工作由国家重点研发计划（2022YFF1002801）、基金委原创项目(32150018)、农业部、科学探索奖、清华大学和北京大学的经费、资源支持。

清华大学刘俊杰课题组长期关注核酸酶机制研究及核酸操纵工具的开发、应用。综合运用生物信息学、结构生物学、生物化学和细胞生物学手段，刘俊杰课题组及合作者已鉴定并开发了多种基因编辑工具(Science, 2024; Cell, 2023; Nature, 2019; Mol. Cell, 2022; Cell Res., 2023) 。课题组长期招募对新型核酸操纵系统挖掘和RNA生物学感兴趣，具有生物信息学、细胞生物学等学科背景的博士后。(实验室网页http://gogolab.life.tsinghua.edu.cn)。

相关论文信息：

https://www.nature.com/articles/s41586-024-07486-x