多能干细胞诱导过程中基因组重编程

      人类成熟个体中有些组织细胞难以再生，如神经元，心肌细胞等，而这类组织再生的实现是当今再生医学领域研究的难点之一。自2007年Takahashi &Yamanaka报导成人成纤维细胞可以用一些转录因子诱导转换为多能干细胞以来，使人们对各种组织细胞实现人工再生充满希望。而将此希望变为现实的重要一环是对多能干细胞诱导过程中基因组重编程机制的研究，

     以受精卵发育变化为例，当原先已经分化好的动物卵子和精子结合形成受精卵时需要重编程转为全潜能型（totipotent state)状态，其基因组称为受精卵基因组（zygotic genome) 。

对于果蝇的胚胎发育，可以观察到在最初的13个同步核分裂（synchronized nuclear divisions）时依赖母亲提供的蛋白核转录子。之后受精卵基因组经历受精卵基因组激活（zygotic genome activation ZGA)，即

重编程以适应转录激活状态，此时来自母亲的蛋白和转录子被新生成的的蛋白和转录子所替代。

    众所周知，转录激活与染色体状态密切相关。在处于关闭状态的基因染色体有两种状态，原始状态（naïve chromatin )染色体和异染色体（heterechromatin ), 核小体是染色体组成的基本单位，后者由一段DNA和组蛋白组成，因此组蛋白的种类与翻译后修饰状态就成为基因转录调控的重要因素之一。如原始状态的染色体中核小体之间由连接组蛋白H1(linker histone H1）连接，而异染色质中的核小体组蛋白的修饰为H3K9me2/3,H3K27me3。

图 1 开放状态染色质，原始状态染色质 与异染色质比较。开放状态染色质可以转录RNA，组蛋白修饰与异染色质不同（浅绿色小旗）。原始状态染色质核小体之间有连接组蛋白H1连接（黄色圆圈），转录处于关闭状态。异染色质除有连接组蛋白H1连接核小体外，组蛋白修饰以H3K9me2/3（红色或浅红色小旗）及H3K27me3(黄色小旗）为主。

基因组重编程过程中其激活意味着上述组蛋白修饰发生改变，Maria Samata 等人的研究揭示早在受精卵基因组激活前，染色体组蛋白H4K16乙酰化就已经形成大的结构域，由此调控核小体的可及性。这与以前H4K16乙酰化标记在体外可以抑制染色体变得紧实的结果相符。( Michael Shogren-Knnak et al  Science 2006 311 844-847)。

    那么染色体较大范围的乙酰化如何引发？即基因组重编程过程中基因组激活何时开始？

       从Takahashi &Yamanaka(2007)的报道得知，成纤维细胞诱导为多能干细胞的必要条件是加入转录因子SOX2, Oct4, Klf4,cMyc，由此推测这四种转录因子是推动基因组重编程的动因。

    要了解这些转录因子如何触发基因组重编程，就需要探究这些转录因子与构成染色体的基本单位---核小体的关系。

    Gareth A. Roberts等人将其中的一个先导转录因子OCT4与组成染色体的基本单位核小体之间的关系做了研究。他们将Oct4 进行系统性变异，观察到对于细胞重编程和多能分化特性的维持OCT4 与核小体之间的作用起重要作用。例如：下图中Del-79位于OCT4DNA结合结构域之中（第236至第240氨基酸残基缺失）），该变异（红色箭头所指）丧失与核小体的结合能力，但与裸DNA结合能力并未降低，甚至比OCT4 的DNA结合结构域的亲和力还高（下右）。那么，这种OCT4变异型是否能诱导多能干细胞的产生？

图2    系统性OCT4 变异位置图（左，红色箭头指 Del-79变异及与核小体或裸DNA结合结果（右） 。黑色OCT4 野生型，绿色：Del-73 变异，蓝色：DNA结合结构域，红色：Del-79。

采用慢病毒四环素诱导系统 lentiviral doxycycline-inducible system在小鼠胚胎成纤维细胞mouse embryonic fibroblasts (MEFs）过表达Oct4, Sox2, Klf4 and c-Myc (OSKM)四种转录因子，诱导转换为多能干细胞。其中OCT4 分别采用野生型和前述del-79变异型。以nanog 表达与否作为多能干细胞的标志。图中可以看出del-79的OCT4变异不能诱导产生多能干细胞，说明与OCT4与核小体的结合是诱导多能干细胞的必要条件。

图3   小鼠胚胎成纤维细胞诱导多能干细胞的实验设计（左）及干细胞标志Nanog 表达状况（右）

现已知可以诱导多能干细胞的这些转录因子（SOX2, Oct4, Klf4,cMyc）为先导转录因子（pioneer transcription factor)   ,   下图显示先导转录因子触发基因组重编程的模型：先导转录因子扫描染色体，当遇到可以结合的位置时结合核小体并替换连接组蛋白H1，以后其它转录因子，辅助激活因子或辅助抑制因子及核小体构像重塑复合物等逐步结合至核小体，以至于组蛋白修饰也发生了改变。

  图 4  先导转录因子的作用

（a) 先导转录因子从两个方向扫描染色体，寻找目标核小体。（b)，先导转录因子暴露染色体上的核小体并替换连接组蛋白。（c) ，先导转录因子可以结合其它转录因子，辅助激活因子或辅助抑制因子以及核小体构像重塑复合物。

为什么首先结合核小体的是先导转录因子而非其它转录因子，Meilin Fernandez Garcia等人的研究揭示了先导转录因子和其它转录因子结合核小体位置的构像有所不同，先导转录因子由较短的锚定alpha-螺旋结构（anchoring alpha helix structure ),更容易结合核小体，而其它类型的转录因子具有延伸的锚定alpha-螺旋结构或无具体结构因此限制了其与核小体结合。

图5 先导转录因子（左）与转录因子（右）结合核小体位置构像比较

先导转录因子结合核小体后，可以引发基因组重编程，如何能够探测到这一动态过程呢？

组成染色体的核小体先组成不规则的并高度动态的10nm纤维，然后再形成30nm纤维，因此，细胞内的染色体呈现似液态的状态，可以延展，折叠，叉指状（interdigitated) ，弯曲，折返绳索状等。

     利用染色质似液态的特征，在分化好的细胞诱导变为多能干细胞过程中，探测核小体上的组蛋白运动状态，从而反映的核小体运动状态，描绘出基因组重编程的动态过程。 即：染色体从异染色质向常染色质转变的状态。

图 6   似液状的染色体结构 ，在无盐环境下10nm染色体纤维可以伸展(左)，在生理盐水条件下（右）呈无规则折叠。

Kenneth Zaret实验室采用Halo标记组蛋白H2B分子，观察单个H2B分子的运动过程以用来反映H2B所在的核小体运动规律。

图 7      蛋白H2B与HALO相连，以JF549显色，在HiLO显微镜下观察H2B单分子的过程运动轨迹。

图 8  染色体的似液态示意图 （左）,       H2B实时运动图(右）

       被标记的H2B分子运动可以看作核小体的运动，在看似无规则的布朗运动轨迹中，Jonathan Lerner选择了两个指标：1，平均运动轨迹长度（average track displacement ) ,2 ,运动（轨迹）范围的半径（radius of confinement )。从下图B中得知这两个指标关系呈线性相关关系。显然，平均运动轨迹长度长，运动轨迹范围的半径大表示染色质的越松散，否则更加密实。

图9   H2B单分子运动的两个指标（A）, 两个指标与染色体运动间的指标（B），染色体运动与异染色质或常染色质的关系（C）。

图例说明：VHMC very high mobility chromatin , HMC  high mobility chromatin ,  IMC  intermediate mobility chromatin , LMC low mobility chromatin , VLMC very low mobility chromatin

采用这套观察系统，可以区分分化好的细胞及诱导成为多能干细胞的染色体。为后续诱导时段分析提供方法。

图  10 已分化的细胞（左）转变为多能干细胞（右）时，LH 转变为HM。

hFib：人成纤维细胞， iPS ：诱导成功的多能干细胞

接下来的问题是分析处于诱导过程不同时相的染色质。分析结果那些内源性先导转录因子被激活的细胞其染色体由异染色质为主转变为以松散结构为主的染色体，并且在诱导第4天和第7天为染色体全局性变化期，而14天与21天为核周围变化期。图11中左图表示分化好的细胞在诱导转变为多能干细胞过程中一些特征的改变，右图表示细胞诱导为多能干细胞或无诱导时前者HM 占优，后者LM 占优。并且在诱导成为多能干细胞过程中，时相1由LM改变为HM是全局性的，时相2 是核周围的改变（A）。而内源性先导转录因子未被激活的细胞在第7天始转变为异染色质为主(B)。

若结合多能干细胞的早期标记和晚期标记出现的时相，就可以判定哪些细胞可能被诱导为多能干细胞，哪些细胞又恢复为成纤维细胞（本文图未显示此内容）。

图 11  分化好的细胞在诱导转变为多能干细胞过程中一些标记的改变（左），成纤维细胞诱导为多能干细胞染色质时相改变(右A)及诱导未成功时染色质变化（右B）。

如前所述，组蛋白翻译后修饰与染色质状态有密切关系（图 1）。Kenneth Zaret 实验室关注了H3K9me3的变化。

       TRA-1-60是人类胚胎干细胞的标志物，可以利用该标记物进行磁珠分选有干细胞标志（TRA-1-60MACS阳性）与无干细胞标志的细胞。并用CHIP比较二者H3K9me3染色体占据情况。由图12中可见阳性细胞H3K9me3信号弱于阴性细胞。

图 12用TRA-1-60对细胞进行磁珠分选，CHIP检测H3K9me3的结果。

由免疫荧光显微镜下观察得知，成纤维细胞诱导形成多能干细胞第7日开始，H3K9me3信号增强，推测此时开始异染色质重新组织（红色箭头所示）。

图13   成纤维细胞诱导成为多能干细胞第4天（day4)，第7天（day 7 ),第21天（day 21) H3K9me3 信号增强（TRA-1-60 +组）。

于是，Kenneth Zaret 提出了在多能干细胞诱导过程中基因组重编程的模型（下图）。这个过程是全局性染色体由紧实转为松散型的过程。全过程可以分为两个时相：先导转录因子扫描并结合核小体的时相与反式作用因子激活时相。在诱导第7天异染色质重新组织。

图14 多能干细胞诱导过程中基因组重编程模式图

     时空动态变化是表观遗传标记的特征之一， 采用单个分子标记记录动态变化的方法契合表观遗传标记特征。H2B单个分子标记运动规律可以大致反映全局核小体时空变化规律。

    但基因组具体位置或具体反式蛋白作用因子的作用等细节仍需今后的工作交待。启动基因组重编程的先导转录因子只有个别研究，缺乏系统研究。以H3K9me3信号为标志的诱导多能干细胞异染色质重组细节也需要提供更多证据。

    总之，以后的工作可能会在目前描述概况的基础上更加细化。

主要参考文献

Gareth A. Roberts et. al. Dissecting OCT4 defines the role of nucleosome  binding in pluripotency.  Nat. cell Biol. 2021 23:834-845

Jonathan Lerner et.al. Two-Parameter Mobility Assessments Discriminate Diverse Regulatory Factor Behaviors in Chromatin. Mol. Cell 2020,79:677-688 

Kazuhiro Maeshima et. al. Liquid-like behavior of chromatin. Curr. Opin. Genet. Dev. 2016 37:36-45

Kenneth S. Zaret  Pioneer Transcription Factors Initiating Gene Network Changes . Annu. Rev.Genet. 2020,54:16.1-16.19 

Maria Samata et. al.  Intergenerationally Maintained Histone H4 Lysine 16 Acetylation Is Instructive for Future Gene Activation. Cell 2020  182 127-144

Meilin Fernandez Garcia  et.al. Structural Features of Transcription Factors Associating with Nucleosome Binding.  Mol. Cell  2019, 75:921-932     

Takahashi Yamanaka et. al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors Cell 2007, 131,861-872