DNA病毒入侵细胞后需要不断增生繁殖，由于病毒携带的基因有限，其基因转录的RNA聚合酶基因缺乏，于是在“劫持”宿主RNA聚合酶II(RNApolII)的过程中影响了宿主细胞RNA水平的平衡状态。这个过程是如何实现的，另外，高度动态变化的病毒晚期基因表达与病毒包装过程的关系如何。Britt Glaunsinger 的工作展现了概况。其工作主要涉及 1, 病毒入侵后联系宿主细胞RNA 降解与合成的通路。2，病毒包装与晚期基因表达的关系。

        1，病毒入侵后联系宿主细胞mRNA 降解与合成的通路

        基因表达的调控是DNA遗传信息传递至蛋白的重要环节，基因表达调控的主要环节在DNA传递给RNA 的过程。截至目前，大量的关于基因调控的文献着眼于涉及RNA聚合酶的转录因子，相关蛋白以及染色质的动态变化。那么，遗传信息由DNA 传递给RNA之后，生产出的RNA 如何影响遗传信息由DNA传递到RNA ？即RNA 的生产量如何影响基因的表达。      mRNA的生产量受细胞的监控，当生产量过多则mRNA被降解，同时mRNA的合成减少(即基因转录水平降低）。如下图。mRNA的稳定性（即降解率）与mRNA合成(即转录）的关系，正常细胞维持一个水平，如虚线所示。当mRNA稳定性降低，（即虚线水平上移）时相应的mRNA合成增加(转录水平升高）。细胞中mRNA的量因此得到平衡（下左图）。但在疱疹病毒入侵细胞后，当mRNA降解增加时，mRNA的转录水平却降低（右下图），病理状态下胞浆内mRNA水平与核内转录水平之间的关系的描述是近年病毒学研究的成果。

BrittGlaunsinger ， 2023

图1 生理状态下mRNA水平与转录关系（左）与疱疹病毒入侵细胞时（病理状态）mRNA水平与转录关系（右）

根据现有的研究结果可知，宿主细胞进入胞浆中的mRNA由RNA结合蛋白结合使其不被降解，但病毒入侵宿主细胞后可以使mRNA降解，宿主mRNA的降解始于病毒基因产物muSOX，在宿主细胞基因产物Xrn1蛋白的参与下mRNA被降解。如下图：

BrittGlaunsinger ， 2023

图2 病毒入侵时其内切核酸酶SOX 与宿主细胞外切核酸酶Xrn1共同作用降解宿主细胞mRNA

那么，胞浆中mRNA的降解信号如何传递至细胞核内影响宿主细胞的mRNA转录呢？ Britt Glaunsinger 的假设是mRNA降解后一些蛋白进入细胞核传递信息。

于是Britt Glaunsinger等人设计了图3实验。

图中左为野生型宿主（WT)，右为变异型宿主（Xrn1 KO)。muSOX为降解宿主mRNA的病毒蛋白(内切核酸酶）muSOX感染的宿主细胞mRNA降解水平升高。D219AmuSOX为完全失活的muSOX蛋白。

         病毒感染宿主细胞后将细胞核与胞浆成份分离。将蛋白成分剪切成片段并用LC-MS/MS检测同位素标记肽段。比较核内蛋白与胞浆中蛋白量的变化。

          从串联质谱（TMT）报道同位素的信号可以知晓胞浆内与核内蛋白整体水平相对变化趋势。从图A看，当muSOX,Xrn1均为野生型时(绿色），与Xrn1 wt/Empty vector载体对照（蓝绿色）相比核内肽段信号更高。

        图B为敲除宿主细胞Xrn1后，muSOX感染与非感染比较。

        图A与图B的结果支持由于muSOX促进mRNA降解后相关进入核内蛋白增加，可能会传递mRNA降解信息的假说。

        从图中左下组比较看（图C），与宿主野生型Xrn1相比（ Xrn1wt/muSOX，绿色），Xrn1敲除后（Xrn1KO/muSOX，紫色）核内蛋白富集相对量减少。表示在病毒蛋白muSOX存在的条件下，Xrn1的活性影响蛋白移入核内。

究竟是哪些蛋白在传递信息呢？在所检测的5994个核内蛋白中，有123个蛋白显示在核中富集（野生型与D219A对照相比）, 这些蛋白中去掉同时在胞浆中也升高的蛋白，去除掉载体对照与D219A对照之间有差别的蛋白。结果剩下67个蛋白。这67个蛋白反映在mRNA降解加速条件下在核内富集的蛋白。

Sarah Gilbertson et al elife 2018:7:e37663

图 4 muSOX表达细胞中明显富集在核内的蛋白，

在上述67个蛋白中有22个蛋白（约33%）是RNA结合蛋白。RNA结合蛋白种类多，应该分析哪些类型蛋白？ 需要从生理状态下mRNA基础降解开始分析：成熟mRNA的标志之一3‘末端有多聚A尾，  mRNA降解从去除多聚腺苷酸开始，去除掉多聚腺苷酸尾的mRNA就可以接着下一步去除帽，并由外切核酸酶（exonucleolytic)将mRNA降解。

由此，胞浆中poly（A）与蛋白的结合状态可以反映mRNA的丰度或降解状况。（当然其他蛋白如polyU结合蛋白，mRNA 3‘UTR 结合蛋白也呈现明显增加。）

接下来的问题是进入核内的mRNA结合蛋白如何将信息传递到转录环节？

     由于病毒基因并不包含RNA聚合酶II, 需要依赖宿主细胞的RNA polII完成。因此一个很好的观察点是观察宿主细胞RNApolII在宿主基因转录启动子上的占据水平。

综合以上的实验结果，实现转录抑制的假设是:核内RNA转录时同时RNA结合蛋白也在转录生成，这样与转录的RNA相匹配及时结合RNA,。当过多的胞浆内的RNA结合蛋白进入核内，此时与核内的RNA结合蛋白形成.竞争性抑制作用 这时改变了转录。关于mRNA 降解水平与基因调控的关系更多细节如转录抑制的细节，RNApolII 全酶中的成份与mRNA结合蛋白的关系等内容参见Britt Glaunsinger实验室（University of Carlifornia）工作。

2，病毒包装与晚期基因表达的关系。

   DNA病毒侵入细胞后进入细胞核，完成其复制，转录及包装的过程（如下左图）。其中病毒基因的转录又分为早期转录和晚期转录。

病毒的包装过程依赖末端重复序列刺破包装膜，在ATP存在条件下将DNA泵入。再切下重复序列。

图 9 病毒包装过程示意图

病毒包装可以调控晚期转录是Britt Glaunsinger 实验室近年来的研究成果之一。该研究的难点在于由于病毒晚期转录复合物是高度动态性的，所测得的蛋白之间的关联只能反映某一时刻的复合物蛋白质的关联性，因此不能采用传统的免疫沉淀法。

对于描述蛋白之间瞬时关联性Britt Glaunsinger 选择晚期转录复合物的蛋白ORF18(因为ORF8在晚期转录复合物中与许多蛋白关联图 右)  筛选与之相关的蛋白。Chloe O. McCollum等利用TurboID 生物素连接酶 在活细胞中可以在10分钟内标记与ORF18相关的周围蛋白，这样可以捕捉到晚期基因表达的瞬时景象。

下左图显示TurboID的原理图(参考文献Kelvin F. Cho et al Nature protocols 2020 15:3971-3999)。右下图是利用三种不同阴性对照获得的与晚期转录表达基因ORF相互作用的蛋白，由于晚期转录的高度动态性，不容易得到重复结果，利用三个不同阴性对照的实验组获得与ORF18相互作用的蛋白，取三个试验结筛选出重叠部份的蛋白共45个进行下一步的验证。

再用晚期基因和早期基因启动子驱动的报道基因分别筛选这45个蛋白基因，采用的方式是CRISPR 基因编辑加siRNA抑制。结果在筛选中发现了以前未曾知晓与晚期基因相关联的基因ORF29，ORF29负责病毒包装的基因，换句话说，病毒包装可能调控晚期基因表达。

制作ORF29病毒变异株，再引入不同功能结构域的ORF29变异，希望观察到是否为APT结合环节，或是APT水解环节，或是核酸酶作用环节影响晚期基因表达。结果显示这三个结构域变异均对晚期基因表达有影响。

           BrittGlaunsinger ， 2023

图12 ORF29无论变异ATP结合结构域（G226A),ATP水解结构域（E321K）或是核酸酶活性结构域（D476A）,均不能挽救ORF terminase 变异株使晚期基因表达水平正常。

于是，BrittGlaunsinger提出了假设(图 13）。

上述两个部分的内容分别对细胞内不同空间（RNA结合蛋白胞浆至核内的穿梭）和瞬间时相（调控晚期基因表达的包装蛋白筛选）的蛋白行为进行检测。后者采用的筛选方法是TurboID标记。TurboID是生物素连接酶，将ORF18与TurboID预先连接，在活细胞内TuboID就可将其邻近的蛋白连接生物素，再以生物素标记纯化并检测到相应的蛋白。由于TurboID作用范围有限，越靠近的的蛋白连接生物素的概率越大，反之亦反。这种标记方式称为邻近标记（proximity labeling (PL)）。PL的特点是反映了活细胞中对不同空间的蛋白辨识。如存在于胞浆中的TurboID不易将存在于核内的蛋白进行生物素标记。这就有效区别出不同空间的蛋白。避免了传统免疫沉淀法可能在细胞溶解过程中，不同细胞器的蛋白可能混合。不仅如此，传统的方法IP 需要将细胞器内的蛋白复合物用离心等方法分离提取出，并且在之后的操作中保持蛋白之间的结合状态 ，一些蛋白之间的结合可能在提取过程中丢失。尤其是一些缺乏膜的细胞内容物容易在提取中蛋白之间失去联系。另外一些弱的蛋白结合容易在IP中丢失。

       另外TurboID连接生物素的速度快，在10分钟内可将周围的蛋白标记生物素，这样利于识别高度动态变化的蛋白复合物。Britt Glaunsinger 实验室正是利用这个特点筛选与ORF18结合的蛋白。虽然只能得到瞬时的图像而非动态的图像，但其优势远超传统免疫沉淀实验。

        关于邻近标记的文献：Anne-Claude Gingras et al  getting to know the neighborhood:using proximity-dependent biotinylation to characterize protein complex and map organelles. Current Opinion in Cgemical Biology . 2019 48:44-54

      Tess C. Branon et al Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID Nat Biotechnol 2018 36(9):880-887

       Kelvin F. Cho Proximity labeling in mammalian cells with TurboID and split-TurboID Nature  Protocols  2020 15:3971-3999