恶性肿瘤是人类生命健康的威胁之一，其细胞的特点之一是生长快，DNA复制频繁，因此，恶性肿瘤细胞内部的DNA复制压力较之正常细胞更大，许多目前使用的化疗药物针对恶性肿瘤细胞的这一特点引入DNA损伤的因素就可以破坏癌细胞。但与此同时，许多正常细胞也同时被杀死。因此化疗的副作用之大令人恐惧。

    能否寻找出既能有效杀死恶性肿瘤细胞同时又不损伤正常细胞的化疗药物是摆在生物科学家们面前的棘手问题，科学家们在这一领域进行了三十余年的努力，获得初步成果，其研究思路值得人们借鉴。

    与青蒿素的研究路径不同，有关新型化疗药物的研究始于对增殖细胞核抗原（Proliferating Cell Nuclear Antigen简称PCNA）蛋白的认识。

早在1978年，两个研究团队分别独立发现PCNA。该蛋白在DNA复制过程中构像呈环状，套在被解链的DNA单链并可沿DNA链滑动，在复制过程中，PCNA用来锚定DNA聚合酶并与许多蛋白相互作用，起到汇聚诸多复制相关蛋白中心的作用，与PCNA相互作用的蛋白至少涉及到冈崎片段加工（Okazaki fragment processing）,DNA 修复，跨损伤DNA复制（translesion DNA synthesis）,DNA甲基化，染色体重塑，细胞周期调控和细胞凋亡等过程。

既然PCNA在DNA复制过程中起集合多种复制相关蛋白的作用，而恶性肿瘤细胞DNA复制频繁，该分子顺理成章地受到癌症学家的关注。

1.癌症相关的PCNA（caPCNA)的发现

  1998年，Pamela E. Bechtel等人用双向电泳发现了癌细胞内存在两个类型的PCNA，一种类型在正常细胞中也存在，而另一种类型则只在癌细胞中可以检测到,即正常细胞中只有一种PCNA,而癌细胞中除正常细胞中有的PCNA类型外，还大量地存在另一种类型PCNA。

他们采用的双向电泳方法可以利用被测蛋白分子的分子量和等电点区分不同的蛋白分子，结果两种PCNA分子量并没有明显的改变，但癌细胞中大量存在的另一种类型的PCNA等电点偏酸性，以后的研究中称这种类型的PCNA为癌相关PCNA(cancer-associated PCNA, caPCNA)。

蛋白的等电点取决于其肽链上氨基酸侧链的不同基团可以显示酸性或碱性，这些不同的总和使得蛋白最终呈现其等电点。肽链氨基酸的组成不同可能导致等电点的不同。作者测序的结果表明两种PCNA的氨基酸组成没有区别。那么，剩下的可能性就是癌细胞环境导致caPCNA等电点偏酸性，即癌细胞环境可能导致caPCNA翻译后修饰与正常细胞PCNA不同。为寻找caPCNA翻译后修饰的特征，Derek J. Hoelz等于2006年从乳腺癌细胞中提取了caPCNA，破解了caPCNA翻译后修饰的氨基酸及修饰基团；结果发现caPCNA分子中由15处氨基酸可以被甲基酯修饰，而被修饰的氨基酸为谷氨酸或天冬氨酸，分别位于E3,E85,E93,D94, E104,E109,E115,D120, E143, E174,D189, E201, E238,E256和E259。这些甲基酯修饰的分布规律是单个caPCNA蛋白分子可能由一个到数个甲基酯修饰而非15个位置全部被修饰，不同caPCNA分子可能甲基酯修饰的位置不同，因此对于甲基酯修饰而言，提取出的caPCNA蛋白是非均一混合物（heterogeneity）。

    由上述研究结果可以推论：caPCNA可能作为癌细胞的标志应用于临床。

2006年，Linda H. Malkas 等人开发出caPCNA特异性抗体，利用该抗体可以检测出肿瘤组织中乳腺癌上皮细胞。

2.利用癌症相关的PCNA（caPCNA)作为靶分子的研究过程

如前所述，PCNA是细胞DNA复制的多种蛋白的汇聚中心，如果该分子的不同类型不仅作为区分癌细胞的标志物，同时将其成为攻击癌细胞的靶分子在临床应用其意义更大。要达到这样的目标 ，需要从阻断PCNA与其它蛋白的联系入手。

   Flap endonuclease-1 (FEN1)是细胞维护基因组稳定，参与DNA复制的重要蛋白。该蛋白与PCNA相互作用行使其功能。 观察已有的PCNA/FEN1相互作用的构像资料，得知PCNA蛋白的三个单体组成环状，中间有DNA穿过，PCNA单体有两个拓扑学上类似的结构域头尾相连，这两个结构域由相互交叉的绳索状环形（loop）肽链相连接。这些loop称为结构域之间的连接loop(interdomain connector loop IDCL), IDCL结构域是与FEN1结合的中关键位置，另外，从该蛋白结晶体X射线衍射分析得知在IDCL范围内PCNA的活动度较大，表明其可以适应与多种蛋白的相互作用。因此，IDCL 是PCNA与FEN1 或其它蛋白相互作用的关键位置。

    IDCL结构域在人类PCNA肽链一级结构中位于距N‘端119-134之间。问题是这段区域正常PCNA与caPCNA有区别吗？

Shanna J. Smith等人利用caPCNA的这段区域制作抗体，看做出的抗体是否能够特异性识别caPCNA，结果显示用位于125-133，126-133，126-135的肽段制作的抗体可以特异性识别caPCNA。至此可以说，与正常细胞PCNA相比，caPCNA 的IDCL区域抗原决定簇发生了改变，也就意味着构像发生了改变。这就为后续寻找化疗用化合物奠定了理论基础。即可能利用构像发生改变的caPCNA IDCL结构域特异性地阻断caPCNA 的IDCL结构域与其它蛋白的联系，而正常细胞PCNA的IDCL结构域不受影响。

这个工作首先从合成caPCNA IDCL结构域短肽段开始。当把这种肽段引入三阴性乳腺癌细胞或神经母细胞瘤细胞后细胞的死亡率增加,说明了其有效性。但肽段作为药物有诸多问题。如给药途径如何避免被降解，进入体内后如何进入细胞等一系列问题。若用化合物代替肽段就有可能实现口服给药治疗的目的。

     根据前述实验结果得知： 位于IDCL区域内的肽段既具有癌相关PCNA的特征又是其他蛋白与PCNA结合的关键位置。那么可以假设可能会有一些化合物可以与caPCNA中IDCL结构域中第126号氨基酸残基至第133号氨基酸残基这一小段区域结合并打断（如FEN1蛋白）与相应蛋白的结合。

然而，天然化合物与人工化合物数目种类繁多，适合的化合物如何寻找？

     近年来随着人工智能的发展，使得研究者不但能够可以预测蛋白质一级结构与蛋白质构像的关系，同时也可将不同立体结构的化合物与特定结构域进行匹配。Long Gu等人的化合物筛选重点关注上述第126到133 氨基酸残基肽段，利用用于构像分析和亚结构药效团分析的计算机软件MOE (Chemical Computing Group, MOEv2008.05).进行筛选。从6.8百万个化合物中选中8000种化合物。再用Glide软件进一步分析将候选分子数量缩小到57个。然后进行实验室验证 ，结果找出称为AOH39的化合物。细胞实验证明对于视网膜母细胞瘤和乳腺癌细胞株有杀伤作用，IC50范围在1.3到3.4μmol/L。但对非恶性细胞株的抑制作用较小，如人类外周血单核细胞，胚胎干细胞等。初步研究发现AOH39可以使癌细胞细分裂停滞于S期和G2>M阶段。

     接下来的问题是是否其选择性地杀死癌细胞的药效是否还可以提高？Long Gu 等人的做法是围绕AOH39的主体结构，合成一系列化学基团稍加改动的化合物，经反复试错发现了另一化合物AOH1160,二者大体结构相似，只有个别基团改变。

AOH1160 具有更高特异性，对恶性肿瘤细胞杀伤作用更大。其IC50范围在0.11到0.53μmol/L而对非恶性肿瘤细胞的作用更小。这样扩大了治疗剂量窗口。

AOH 1160 虽然在动物实验中有上述效果。但仍有其缺陷： 可溶性差并且在体内代谢环境下稳定性也差。在口服给药时需要采用热溶解配方。显然该化合物并非用于口服化疗的最佳选择。

Long Gu等在AOH1160 结构的基础上对该化合物某些位置的化学基团进行替代结果得到溶解效果更好的AOH1160-1LE，进一步修饰其结构在AOH1160末端苯环上加了甲氧基得到AOH1996，虽然只是个别基团的改变，但与AOH1160相比AOH1996抑制肿瘤细胞的作用相当但在体内代谢更具稳定性。在鼠体内的半衰期从3.4小时(AOH1160)提高到4.33小时(AOH1996)，按百分比计算提高了27%

作者用AOH1996 作进一步实验：采用70个恶性细胞株检测，对这些细胞株的50%生长抑制浓度中位数为300nM..而对于非恶性细胞株至少10uM。二者相比较恶性癌细胞与非恶性细胞株对AOH1996的敏感性至少相差30倍。小鼠体内实验表明：小鼠移植神经母细胞瘤细胞，乳腺癌细胞和小细胞肺癌细胞后按40mg 每公斤体重口服AOH1996，数十天后肿瘤体积与对照组相比明显缩小。而小鼠体重与对照组相比并未见明显减轻。

尚未见到临床实验的结果。

3.关于AOH1996作用机制研究。

AOH1996的作用机制研究从其影响PCNA与其他蛋白的相互作用开始，Long Gu等利用免疫沉淀和Mass Spectral analysis显示AOH1996可以改变一半以上与PCNA-染色体相关蛋白均发生改变，这些蛋白与转录过程相关。其中只有两个蛋白RPB1 和POL2B结合于PCNA APIM模体（motif）上，这两个蛋白均为RNA聚合酶II的亚基。RPB1是RNA聚合酶II的最大亚基，其磷酸化修饰调控转录，AOH1996可以促进PCNA与RPB1的结合，增加了复制（由PCNA参与）和转录（RPB1参与）两个过程的相遇，而这两个过程相遇可以导致转录-复制之间的冲突（transcription-replication conflict, TRC）。

关于TRC的现象最早在原核生物细胞研究中发现：DNA的双链无论在转录成RNA过程还是本身的复制过程均需要打开变为单链。若在同一染色体区域内同时发生复制和转录时，RNA聚合酶与复制体（replisome）相遇不可避免，（因为复制体移动速度为RNA聚合酶II移动速度的12倍，不论两者是同方向或反方向均会相遇。相遇后停顿的（paused or stalled）RNA聚合酶就阻碍了复制体的移动导致DNA损伤。在二者相遇的位置可以观察到DNA双链的断裂（DNA double-strand breaks(DSBs)。而转录过程中形成的RNA与DNA杂合链R-loop 与DSBs 相关。采用电镜，双向电泳，DNA 聚合酶染色体免疫沉淀实验均证实了转录与复制相遇后导致复制叉停顿（stalling），后者常伴随DNA损伤或重组从而危及细胞生存，因此，RNA聚合酶与复制体的相遇可以发生冲突，称为转录-复制冲突。为了避免这样的冲突，细胞内有一些机制防止TRC的产生，使得二者在空间上或在时间上避免相遇。而AOH1996促进PCNA蛋白与RNA聚合酶最大亚基的结合，显然破坏了这种机制，加剧了TRC。

采用修饰的胸苷类似物（modified thymidine analog ,CIdU）掺入法观察复制叉的延伸发现AOH1996处理组IdU掺入的链明显缩短,R-loops积蓄。这也是促使细胞DNA损伤的证据。

如前所述，除RBP1外有很多蛋白受AOH1996的影响，而这些受影响蛋白的后续机制尚未被揭示，因此，AOH1996导致细胞死亡的机制研究远未完结。

4.与本研究相关的时间线回顾

1987年  两个研究小组分别发现PCNA 蛋白分子。

1998年 癌细胞中等电点偏酸性的癌相关PCNA发现。

2005年PCNA/FEN1晶体构像图发表。

2006年 发现癌相关PCNA 甲基化酯修饰。

2006年  根据上述基础研究的结果，考虑可能将癌相关PCNA可能作为癌细胞的标志物，因此开发检测的癌相关PCNA抗体。

2015年 发现癌相关PCNA IDCL结构域中第126至第133号氨基酸的构像与正常细胞中PCNA同样位置构像不同，这意味着干扰癌相关PCNA该区域与其它蛋白结合，有可能特异地杀死癌细胞。首先，具有乳腺癌细胞毒性的针对caPCNA IDCL 结构域的短肽段开发。

2018年 在证明该区域短肽段可以有效抑制癌细胞的基础上，尝试利用计算机虚拟筛选与该区域结合的化合物，结果筛选出 AOH 39。 再围绕AOH39 的基本结构合成个别基团不同的化合物再进行试错实验，找出AOH1160 。这两种化合物均具有抗癌活性，但后者抑制癌细胞的作用更强。 

2023年 适合于生物体内代谢的抗癌活性小分子AOH1996 化合物筛选成功。

      由上可见：从从PCNA发现至癌相关PCNA的发现共计11年时间，从癌相关PCNA至相关抗体的开发用了8年时间，其后9年抗癌肽段合成，再过8年可能用于临床治疗的AOH1996化合物制成。每一个关键节点形成需要8-9年时间。从基础研究和应用研究角度划分，前者约19年时间（1987-2006），后者约17年时间（2006-2023），可见基础研究的重要性。诚然，2023 之后临床研究的时间尚未知。

5.展望  上述研究中应用研究较多，相应的理论研究似乎有待完善，至少有以下三方面尚未看到深入研究：

5.1，甲基化酯如何修饰相应的氨基酸，除PCNA蛋白外，其他蛋白是否也存在甲基化酯修饰的区别，甲基化酯基团如何加至肽链中天门冬氨酸或谷氨酸上，其它氨基酸与甲基化酯修饰的关系，甲基化酯修饰后的基团动态变化机制，正常细胞与恶性癌细胞中PCNA甲基化酯修饰的不同其机制如何等，这些基础研究将对今后的抗癌药物开发奠定理论基础。

5.2，PCNA相互作用的蛋白不少于100个，本研究选取的靶结构域为ICDL,其它结构域是否也可能是潜在的靶点，与PCNA相互租用的其它蛋白是否也可能成为抗癌药物的靶点，该研究设计的靶点IDCL结构域的扰动除影响DNA复制与转录冲突状态外，对细胞其它通路影响如何等，这些研究可能在今后的文献见到。

5.3，尚未看到AOH1996在体内副作用的研究，AOH1996的代谢具体机制如何，其可能存在的毒副作用有哪些，机制如何，AOH1996是否抗癌最佳化合物等，这些研究想必会有论文发表。

      5.4，纵观上述研究过程，AOH996的研发始于对其靶分子PCNA的基础研究，以后逐步从癌相关PCNA甲基化酯修饰，抗体的开发而用于癌细胞的检测，以至后来的小分子化合物的开发，这一系列过程均需基础研究的积累，历经20余年。但近年来随着人工智能的发展，蛋白氨基酸一级结构与其构像关系的推测可以在计算机软件中实现。同理，小分子化合物与其靶蛋白构像的关系也可由人工智能推测，这就大大减少了真实实验室验证的工作量，可以预测，类似AOH996的研发过程今后可能会大大缩短。

综上，随着临床试验数据的披露，化合物AOH1996可能成为新一代的广谱化疗药物。

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