细胞内第二信使信号通路，比如说本文研究的环磷酸腺苷 (cAMP)，对细胞的功能起到多方面深度调控作用。其中包括环磷酸腺苷介导神经调控递质的功能，例如去甲肾上腺素(norepinephrine)和多巴胺(dopamine)，对不同脑内神经环路以及人和动物的情绪和行为的调节。神经调控通路中的缺陷会导致多种神经系统性和退行性疾病，包括帕金森病，精神分裂症和药物上瘾。

环磷酸腺苷和其他第二信使信号通路的一个关键特点是细胞特异性。不同的神经元常常表达不一样的神经调控递质受体，导致同样的神经调控递质可能会在不同神经元中差异性地、有时相反地改变环磷酸腺苷浓度，进而对不同的神经元导致不一样的功能改变。环磷酸腺苷浓度的改变甚至可以发生在亚细胞水平上。也就是说在一个细胞内不同的区域，环磷酸腺苷可以有不一样的局部改变。

由于环磷酸腺苷对神经调控和其他细胞发育和功能，以及对疾病的巨大作用，多个实验室已经研究开发了超过 50 种基因编码的环磷酸腺苷分子探针，用于结合显微成像方法在细胞和亚细胞水平上检测环磷酸腺苷的变化。可是，虽然已有的环磷酸腺苷分子探针已经成功地在离体细胞和脑片标本中使用，在要求更高的完整动物的在活体大脑中的应用，特别是在动物行为进行中的使用一直充满挑战。

为了实现在活体中实用的环磷酸腺苷成像，钟海宁团队和毛天怡团队在相同条件下系统比较了现有的环磷酸腺苷分子探针，并且在目前最好的探针的基础上通过分子结构分析和定点变异相结合的方进行了进一步优化，最终开发得到了三款不同敏感度的基于荧光共振能量转移的新一代探针，统称为cAMPFIRE (cAMP Fluorescence Imaging Reporters based on Epac)。和上一代探针相比，cAMPFIRE对环磷酸腺苷的检测敏感度可以增加到10倍以上。在细胞中，cAMPFIRE探针对胞外经典神经调控递质去甲肾上腺素的反应灵敏度可以提高 100 倍以上。

图：（上)：分子探针结构和结合cAMP以后结构变化示意图。（左下）：和现有（parental）的探针比较，cAMPFIRE（-L，-M，-H）极大提高了对神经递质的敏感度。（右下）：cAMPFIRE探针可以在单细胞分辨率水平上检测到动物行为，包括运动 （speed）对环磷酸腺苷浓度的细胞特异性调节。

cAMFIREs探针的一大优势是它们可以和多种成像方法相结合，包括比率法显微成像和荧光寿命显微成像。比率法显微成像在许多实验室中更容易实现，但是荧光寿命成像在半透明，对光有散射作用的脑组织中可以进行更准确有效的检测。作者使用活体双光子寿命成像成功地在小鼠大脑皮层神经元中和在单细胞和亚细胞分辨率上展示了环磷酸腺苷的动态。

实验结果揭示，在清醒的动物中，大脑皮质神经元具有一定的基础水平环磷酸腺苷。这个基础水平依赖于动物的觉醒状态，并且可以被肾上腺素受体在亚细胞水平上调控。成瘾药物吗啡会普遍性地在这些神经元里降低环磷酸腺苷水平，而运动会在不同神经元中触发细胞特异的环磷酸腺苷上升或者下降。

密歇根大学的叶冰实验室使用cAMPFIRE探针也展示了在果蝇幼虫神经元中的原位实时环磷酸腺苷成像。这些cAMPFIRE分子探针应当可以在将来广泛实用于在体和离体研究环磷酸腺苷介导的信号调节，神经功能和动物行为，以及用于对于环磷酸腺苷通路的高效药物筛选。

注：所有探针质粒可在 Addgene 上获得：

https://www.addgene.org/browse/article/28224671/

相关论文信息：

https://doi.org/10.1038/s41592-022-01646-5