3D生物打印案例- 间接3D生物打印法构建神经导管

四川大学华西医院苟博士团队在2016年发表的文章《3D-engineering of Cellularized Conduits for Peripheral Nerve Regeneration》，今天对这篇文章进行解读，通过文章了解3D生物打印的研究思路和应用案例。

一、  实验简介

本研究描述了一种间接3D生物打印技术来制备具有用于周围神经再生的神经导管的方法。该生物导管由冷冻聚合的明胶甲基丙烯酰基（cryoGelMA）凝胶和脂肪来源的干细胞（ASCs）组成。通过使用3D打印的“锁和钥匙”模具进行建模，cryoGelMA凝胶被构造成具有不同几何形状的导管，例如设计的多通道或分叉和个性化结构。cryoGelMA导管是可降解的并且可以在体内 2-4个月完全降解。cryoGelMA支架支持种子ASCs的附着，增殖和存活，并且在体外上调其神经营养因子mRNA的表达。在植入大鼠模型后，生物导管能够支持穿过10mm坐骨神经间隙的再支配，在功能和组织学评估方面的结果接近自体移植物的结果。     

本研究有三处创新之处，一是选择了间接3D生物打印的方式，可以个性化，产业化的制造神经导管，为临床应用提供了基础；二是是使用GelMA这种较少的细胞毒性和生物降解性高，并且可以促进改善神经再生；三是添加ASCs，显示了促进神经再生的潜能。

图1：实验技术路线图

二、  神经导管的3D构建

图2：用于周围神经再生的3D工程生物导管的示意图（来源于文献）

具有“锁和钥匙”结构的模具通过间接3D打印技术制造。然后制造cryoGelMA NGC并用ASC接种以桥接10mm坐骨神经缺损。

图3 间接3D生物打印构建的神经导管模型

具有复杂几何形状（例如多通道（A）和分叉（B））的cryoGelMA NGC的计算机模型和照片。根据MR神经影像重建患者的坐骨神经，然后制作个性化的NGC（C）。

三、3D构建的神经导管的生物安全性试验

图4：在大鼠坐骨神经横断模型中用于神经修复的cryoGelMA NGC的制造，表征和降解。

（A）测量横切的坐骨神经的直径，以用于NGC的设计和制造。（B）NGC的SEM显微照片。（C）在II型胶原酶（1mg / ml）溶液存在下体外降解NGC （n = 3）。（D）在植入后1,2,4和8周时，大鼠背部皮下可生物降解的NGCs的照片（比例尺= 5mm）。（E）植入后不同时间点（1,2,4和8周）NGC的组织切片的代表性H＆E染色（比例尺=200μm）。

图5：ASC 在体外对cryoGelMA NGCs的附着，增殖，存活和神经营养因子的分泌。

（A）细胞接种2天后NGCs上ASCs的死/活分析（比例尺=200μm，左上角插图中的比例尺=25μm）。（B）用rhodamine phalloidin对F-肌动蛋白的染色。培养2天后，ASCs铺展在NGCs表面（比例尺= 200μm，左上角的比例尺= 25μm）。在TCP养瓶（聚苯乙烯培）（C）和NGCs（D）上培养的ASCs的SEM显微照片。（E）在培养1,2和3天后对TCP和NGCs上ASCs增殖的分析（n = 3）。（F）在接种后2天，TCP和NGCs上的ASCs的主要神经营养因子（NGF，BDNF和GDNF）的基因表达。*与TCP比较* p <0.05。

四、3D构建的神经导管的功能性验证

图6：大鼠坐骨神经横断模型植入cryoGelMA NGCs后2,4,8和16周大鼠的SFI值（n = 4）

大鼠坐骨神经横断模型已被广泛用于评估组织工程化NGCs促进体外周围神经再生。将cryoGelMA NGCs植入损伤的坐骨神经，通过制备的四组（假手术组，自体移植组，NGCs，NGCs + ASCs）评估神经再生行为。为了评估坐骨神经的功能恢复，对术后2、4、8、16周大鼠模型进行步行轨迹分析。

坐骨神经功能指数（SFI）由Bain 等人提出的公式进行计算：

图7：术后4,8和16周不同治疗组再生神经的电生理评估

（A）在植入后16周，每组受伤侧的代表性CMAP记录。记录术后不同时间点CMAP（B）峰值，NCV值（C）和CMAP发作潜伏期（D）。

*P <0.05与移植组比较；^# P <0.05是与NGCs组比较。

图8：用于大鼠坐骨神经横断模型中的神经再生的cryoGelMA NGC的术中照片。

（A，B）切断大鼠坐骨神经以产生10mm间隙并与3D印刷的NGC桥接。手术后16周假手术组（C），自体移植组（D），NGCs组（E）和NGCs + ASCs 组（F）再生坐骨神经的一般观察。

图9：术后16周时远端段再生坐骨神经的组织学评估。

（A）H＆E染色显示每组中神经形态的概述（比例尺=200μm）。通过甲苯胺蓝染色（B，比例尺=25μm）和TEM（C，比例尺=5μm）显示再生神经髓鞘化。每组（n = 4）的有髓神经直径（D）和髓鞘厚度（E）的统计分析。

图10：腓肠肌萎缩和再神经支配。

（A）假手术，（B）自体移植物，（C）NGCs和（D）NGCs + ASCs，植入16周后的组的腓肠肌横截面的H＆E染色（比例尺= 100微米）。（E）肌纤维的平均直径和（F）不同组中手术侧至非手术侧的湿重（n = 4）。

五、 研究创新点：

5.1 间接3D生物打印法构建神经导管的优势

传统制造的NGCs是简单的圆柱状结构，且复杂结构的NGCs的制造是困难和耗时。同时，传统的方法制造具有通用的结构参数的NGCs，如内直径或壁厚等是不可行的，可能影响神经再生疗效。利用间接3D打印技术，我们可以可靠地制造具有高级结构（多通道，分叉等）和控制结构参数的NGC。另外，文献中尝试将3D打印方法与MR神经影像集成在一起，根据患者的解剖几何学设计NGC，从而可以定制与患者的特定神经缺陷精确匹配的NGC。文献报道中的技术在制造具有复杂或个性化几何形状的NGC用于周围神经再生方面具有简单性，灵活性和低成本方面的优势，这可能导致未来NGC的临床应用的发展。

5.2 基于GelMA+ASC构造的神经导管的再生能力增强

体外和体内降解的研究表明，cryoGelMA构造的NGCs是具有适当的降解速率（在2-4个月完全降解），其类似于几个FDA批准的NGCs，如Neurotube ^®和AxoGuard ^TM神经连接器。同时GelMA是细胞相容性生物材料，文献中研究发现在NGCs上培养的ASCs比在TCP上产生更多的ECM积累。此外，在NGC上接种ASCs后，几种神经营养因子mRNA（例如BDNF）的表达不受调节。NGCs上细胞与细胞 - 基质相互作用的增强为ASCs提供了更加生理学相关的环境，从而增强了它们的功能。这些结果表明，将ASCs引入cryoGelMA NGCs可能为神经再生提供有利的有利于修复的环境。

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六、 事后诸葛

文章非常具有创新性，且整体的实验设计非常严谨。但是，整体的神经导管的构造是否可以再优化？

6.1 直接3D生物打印：

文献中是采用的间接3D生物打印构建的神经导管，如果选择更加高级一点的3D生物打印机（例如 envisionTec，发表研究论文中使用最多的一款打印机；ALLEVI，性价比最高的一款打印机，90%的用户是科研院所），是可以直接3D生物打印的。当然，目前3D生物打印还存在精度问题，先打印模型，在进行浇灌是十分讨巧的制造方法，既保证了精度，又增加了结构复杂度的可定制性。

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6.2 蓝光固化代替冷冻固化

文献中选择的普通打印机，不能够进行蓝光固化，所以多了冷冻固化的过程。如果采取加装蓝光固化光源（ALLEVI自带）的打印机，GelMA和ASCs可以直接混合后直接进行3D生物打印，打印的同时进行蓝光固化（GelMA在蓝光引发剂存在的情况下，可以直接蓝光固化。Gelatin不可以）。这样流程上会更加精简，更加有利于临床应用。

借助3D生物打印这个通用工具，选择更贴近自然的生物材料，再加上具有再生能力的ASCs，仿生的神经导管将会越来越接近自体移植的神经导管。

文章下载链接 

• doi：10.1038 / srep32184

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