实验背景
       光聚合作用是一种常见的工艺，用于固化各种应用中的材料，包括牙科，电子学，印刷，光学和组织工程（2）。这个过程允许负载细胞的水凝胶从液体状制备成固体状，具有空间和时间控制，在生理条件下快速固化速率和最小发热量等优点（2）。
光引发剂通常用于生物打印作为胶凝过程的一部分以固化生物墨水，但研究表明，这种交联过程可能会影响细胞的生存率（1）。该研究用光引发剂Irgacure和苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂（也称为LAP ）测试了聚合过程中各步骤对细胞活力的影响。虽然暴露于自由基或Irgacure表明生存能力下降，但光照和暴露于LAP本身并不影响生存力。当与GelMA一起使用时，自由基聚合过程不会影响到细胞活率。
聚合过程的各个部分，例如暴露于潜在有害的波长，自由基或光引发剂本身会伤害细胞并影响生存力（3）。这项研究测试细胞暴露于光，光引发剂Irgacure和LAP（biokey），由这些引发剂产生的自由基，并最终完成BioGel聚合的整个自由基聚合过程。
实验结果
曝光
将在96孔板中培养的细胞暴露于强度为10mW / cm 2的365nm（LED ENGIN）或405nm（LED ENGIN）光2分钟，然后与不曝光的对照进行比较。ATP数据（图1）表明所有组的生存力从第1天到第7天都有所改善，各组间在每个时间点上没有统计学差异。
 
图1：  暴露于365nm和405个2D对照的细胞。ATP数据显示所有组的第1天至第7天的存活力都有所提高。在各时间点组间没有发现统计学差异（p <0.05）。
添加光引发剂
首先，在搅拌和加热（65℃）下将0.5％（w / v）LAP溶液和0.5％（w / v）Irgacure溶液溶解在细胞培养基中。然后，将在具有LAP或Irgacure的96孔板中培养的细胞暴露于10nm / cm2强度的405nm光2分钟，然后与未暴露于光的光引发剂培养的细胞对照相比较。每组拍摄的亮视野图像表明改变了用Irgacure培养的细胞或那些用LAP或Irgacure暴露于光下的细胞的细胞形态（图2）。没有引发剂的细胞和没有光暴露的具有LAP的细胞表现出与2D对照相似的细胞形态。ATP数据显示暴露于不含光的LAP的细胞与没有任何光敏引发剂的细胞相比没有统计学差异。

 
图2：在暴露于没有引发剂，LAP或Irgacure的0,30和120秒蓝光后24小时的细胞的明场图像（10x）。典型的成纤维细胞形态在没有引发剂的组中以及暴露于 Biokey（LAP）和0秒蓝光的细胞中是明显的。其他组的异常形态明显。

 

图3：超过72小时的ATP结果显示没有引发剂的组以及暴露于BioKey（LAP）和0秒蓝光的组之间没有统计学差异。暴露于Irgacure或光引发剂和蓝光的组具有统计上较低的ATP活性。具有不同（*）的组表示统计学差异（p <0.05）。

自由基聚合工艺可行性
 
图4：在用BioKey（LAP）和Irgacure光引发剂交联的BioGel（GelMA）上接种细胞。具有不同（*）的组表示统计学差异（p <0.05）。用0.5％（w / v）LAP或Irgacure分别产生10％（w / v）GelMA的薄膜。通过暴露于405nm或365nm波长聚合后，将细胞接种到每个薄膜上。在第1天和第3天，在这些组中都没有发现ATP活性的统计学差异和组织培养聚苯乙烯（TCPS）的2D对照。在第7天，两种细胞接种到GelMA和LAP上，接种到GelMA和Irgacure上的细胞表现出更高的ATP活动比2D控制。
结论
       自由基聚合是细胞包封和3D细胞培养的通用方法。这个过程的各个部分对细胞有潜在的毒性，包括暴露于某些波长，自由基和光引发剂本身。该研究测试了与GelMA的光交联有关的该聚合过程的各个部分。暴露于聚合该生物材料所需时间的365nm和405nm波长不影响细胞活力。
      当暴露于活化的光引发剂时，Irgacure和LAP的细胞活力均下降。没有单体发生反应，光引发剂的活化会释放永不终止的自由基，使细胞长时间暴露于这些颗粒。正如预期的那样，这种暴露导致细胞活力下降，这通过明场成像和ATP活性是明显的。然而，当与光可交联材料如LAP组合使用时，细胞活力不受影响，如通过ATP活性所证明的。
暴露于未活化的Irgacure也会影响生存力，因为暴露于没有光的引发剂的细胞表现出比2D对照更低的ATP活性。暴露于未激活的LAP不会影响活力，这表明当光敏交联载有细胞的材料时，该光引发剂可能是Irgacure的更好替代品。
      这项研究表明，光聚合过程可以创造可行的3D蜂窝结构。尽管Irgacure和LAP在与GelMA结合时产生能够支持活细胞群的水凝胶，但是暴露于Irgacure即使没有激活自由基也降低了细胞存活力，这表明LAP可能是用于制造光交联的细胞负载水凝胶的更好的替代方案。
实验方法
细胞培养
      使用补充有10％胎牛血清（Hyclone）和1％青霉素 - 链霉素 - 琼脂糖的Dulbecco改良培养基（Corning），在37℃和5％CO2的单层培养物中培养从ATCC获得的原代人新生儿真皮成纤维细胞（HNDF）两性霉素（康宁）。使用12以下的段落数。
薄膜制造和细胞种植
      为了制造薄膜，首先按照Allevi提供的方案中的建议处理玻璃盖玻片。然后，在搅拌和加热（65℃）下，将0.5％（w / v）LAP溶液和0.5％（w / v）Irgacure溶液溶解在细胞培养基中。接下来，GelMA（购自 Allevi 备注，司特易有相同品质但价格便宜近一半的生物墨水）在各溶液中以10％（w / v）混合。在混合物完全溶解和均匀后，如Allevi提供的方案中所建议的那样将其无菌过滤（0.22μm）（Millipore）。
一旦过滤溶液，将各溶液加热至37℃，并以15μl移液至特氟隆板（McMaster）上。然后将处理过的玻璃放在液滴的顶部并压下以均匀地分散材料。接下来，将溶液暴露于用于LAP膜的蓝光（405nm）（LED ENGIN）或用于Irgacure样品的365nm（LED ENGIN）光。然后将粘在玻璃上的薄膜从特氟隆片上取下并放入24孔板中。（康宁）
将HNDF以250,000个细胞mL-1的浓度悬浮并移液到含有GelMA薄膜的孔中。使用足够的细胞溶液浸没样品。过夜孵育后，交换培养基。
样品分析
       为了评估细胞活力，根据制造商的方案进行CellTiter-Glo 3D ATP分析（Promega）并使用BioTek Synergy 2 Plate Reader分析。
使用方差分析（ANOVA）测试进行统计分析以确定处理组之间是否存在差异。如果差异由方差分析确定，则使用事后Tukey多重比较测试来确定测试组之间的统计学差异。所有分析均使用95％置信水平（α= 0.05）。图上的误差线表示与平均值的标准偏差。

实验中LAP可选用 Stemeasy细胞相容性生物墨水蓝光引发剂LAP 产品链接GelMA 可选用Stemeasy TM 蓝光固化细胞相容性生物墨水系列产品链接
参考文献
[1] B. D. Fairbanks et. al, “Photoinitiated Polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility,” Biomaterials, vol. 30, no. 35, pp. 6702-6707, Dec 2009.
[2] Nguyen, Kytai T. et al Photopolymerizable Hydrogels for Tissue Engineering  Applications. Biomaterials 23 (2002). pp 4307-4314.
[3] Williams, Christopher G. Variable Cytocompatibility of Six Cell Lines with Photoinitiators Used for Polymerizing Hydrogels and Cell Encapsulation. Biomaterials 26 (2005) pp 1211 – 1218.
[4] J. K. e. a. Carrow, “Polymers for Bioprinting,” in Essentials of 3D Biofabrication and Translation, Elsevier Inc, January 2015, pp. 229-248.
[5] Nguyen, Kytai T. et al Photopolymerizable Hydrogels for Tissue Engineering  Applications. Biomaterials 23 (2002). pp 4307-4314.
[6] B. T. et al., “The 3D Printing of Gelatin Methacrylamide Cell-laden Tissue-engineered Constructs with High Cell Viability.,” Biomaterials, vol. 35, pp. 49-62, 2014.

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作者编译自 Allevi 官网

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