质粒是基因组外能够进行自我复制的DNA片段。1952年Lederberg将胞质内的遗传因子命名为质粒，即Plasmid，其中plasm来自胞质cytoplasm，而it则是拉丁文的it。在20世纪70年代之前，关于质粒的研究一直不温不火，这是以Delbruik为代表的噬菌体小组（Phage group）的全盛时期。1974年Annie Chnag和Stanley Cohen利用DNA剪接技术组装了一个“混合质粒”。他们将葡萄球菌质粒上的一个抗药基因利用来自细菌的限制性内切酶剪切下来，连接进大肠杆菌的质粒（pSC101）中。这也是DNA重组技术的滥觞，pSC101质粒便是第一个分子克隆载体。到1977年，已有超过650种质粒被发现。常用的质粒中，p15A质粒于1968年在大肠杆菌中被发现，克隆表达载体pUC于1982年被构建，这些质粒在分子克隆实验中都得到了广泛使用。

质粒这个概念提出距今已逾半个世纪，我们发现质粒搭载了多种多样的功能基因，包括抗药性，抗逆性以及致病基因等等，在细胞生理过程中发挥了重要作用。质粒也被大量的用于搭载人工基因线路，在疾病治疗，农业生产等领域有着潜在的应用。然而时至今日，人们对它的定量了解仍然十分匮乏。针对不同拷贝数的质粒，可以利用诸如RT-PCR等手段对群体平均拷贝数进行测量。然而RT-PCR依赖DNA片段的指数扩增，并不是一种精确的测量手段，在绝对定量层面也存在限制。另外质粒在单细胞水平的分布具有异质性，这种异质性如何影响功能基因的表达，又如何影响人工基因线路的构建和实现，目前也不明晰。

我最近发表的文章“Single-cell measurement of plasmid copy number and promoter activity”，介绍了一种在单细胞水平标记和定量质粒拷贝数的技术。我将该技术与mRNA活体标记技术相结合，实现了对启动子强度的绝对定量。该工作于麻省理工学院Chris Voigt实验室完成，也是与美国国家标准技术研究院进行的一个合作项目。

在该方法中，我们利用了DNA结合蛋白PhlF和荧光蛋白RFP的融合蛋白对质粒DNA进行标记和定量。在需要标记的质粒中引入多个PhlF的结合位点，这样包含荧光蛋白的融合蛋白就会结合在质粒DNA上，在细胞中形成聚集的荧光信号，可以利用定量荧光显微镜对其强度进行测量。通过图像处理和校准，我们对不同拷贝数的质粒在大肠杆菌内单细胞水平的分布进行了观测。我们发现质粒在细菌群体内的分布并不均匀，群体内部的差异性其实很大。即使在抗生素选择压力的存在下，也存在一些细胞只包含很少数量的质粒。我们也提出了一个描述了质粒复制和在子细胞中分配的简单数学模型用以描述这些分布。这部分结果让我们感到比较意外，它不仅提供了质粒生物学一个基本图景，也让我们意识到单细胞水平的异质性对人工基因线路精准设计所构成的挑战。

在对DNA水平进行定量的基础上，我们接下来对mRNA水平进行了单细胞水平的测量。针对mRNA，人们已经开发了一系列活体定量技术。其中有代表性的是以MS2/PP7为代表的基于RNA结合蛋白的技术。比如在大肠杆菌中Ido Golding等人利用MS2蛋白对mRNA进行标记，发现转录过程具有爆发性（bursty）。不过该技术在原核生物中的应用还有一些缺憾，比如影响mRNA降解，没有经过校准，动态范围不确定等等，仍需要进一步的改进。我们这里利用RNA结合蛋白PP7与蓝色荧光蛋白CFP的融合蛋白，通过对在标记mRNA内引入PP7结合位点，实现了mRNA的荧光标记和单细胞水平测量。针对不同强度的启动子我们做了系统的测量。我们发现该技术具有比较大的动态响应范围，能够实现三个数量级范围内的活体细胞mRNA水平定量。同时它对mRNA降解的影响比较小，被标记的mRNA能够在数分钟内被降解。同时该技术也适用于多种生长条件，包括对数生长期和平台期等。

我们进一步结合DNA和mRNA定量技术，利用三种不同的荧光蛋白在细菌中实现了中心法则三要素的同时定量，对启动子强度进行了单细胞水平的精确刻画，为合成基因回路的精确组装提供了定量基础。另外我们也将该技术应用于不同生长期的大肠杆菌，以及另外一种非模式原核生物需钠弧菌（Vibrio natriegens）。我们发现处于生长平台期的大肠杆菌相对于指数生长期，具有更高的质粒拷贝数，而转录水平维持在较低水平，启动子活性较低。对于需钠弧菌，我们发现质粒在细胞内的空间分布和大肠杆菌有所不同，而同样的启动子，其转录活性也有较大差异。进一步的理论研究可以帮助我们揭示其背后的数量规律。

以上是我们文章的主要内容。由于工作性质的关系，我也多次访问位于盖瑟斯堡的美国国家标准技术研究院（NIST）。NIST保存有大量的标准物质，不仅包括国际单位制对应的标准件，也包括具有特点化学成分和物理特性的材料。这些标准物质看起来不起眼，但它们其实构成了现代工业和科技的根基，也是物质科学领域进行定量，改造和设计的基本语言。针对生命科学领域，如何发展类似的系统的定量技术和通用的设计语言是一个值得思考的问题。传统生物学偏重机制研究（mechanism），往往关注关键蛋白和通路，使用的是形式化的语言。即便很多基本过程，定量做的也不是很充分。而由于生物过程存在噪声，定量技术的精度有着天然的限制，难以像物理常数一样不断提高测量的精细水平。如何在这种受限的情况下，发展新的基础理论与进行工程实践，可能还是一个比较大的挑战。

Reference:

Shao, B., Rammohan, J., Anderson, D.A., Alperovich, N., Ross, D., and Voigt, C.A. (2021). Single-cell measurement of plasmid copy number and promoter activity. Nat Commun 12, 1475.