氢气抗肿瘤机制：调控巨噬细胞极化

氢气通过调控巨噬细胞极化抑制慢性间歇性缺氧状态下的肿瘤生长

摘要

肺癌的临床治疗依旧面临巨大挑战，现有治疗手段往往难以有效遏制疾病进展。慢性间歇性缺氧（CIH）是阻塞性睡眠呼吸暂停（OSA）的特征性病理表现，已有研究证实其会促进肿瘤侵袭与转移。本研究旨在探究氢气作为肺癌新型辅助治疗手段的潜力。本研究构建体外、体内模型评价氢气的治疗效果。体外构建间歇性缺氧（IH）肿瘤细胞‑巨噬细胞共培养体系，检测细胞增殖、迁移以及巨噬细胞极化表型；体内建立慢性间歇性缺氧小鼠荷瘤模型，监测肿瘤生长，并采用免疫组化、蛋白质免疫印迹（Western blot）分析组织样本。结果显示，氢气在体内具备显著抗肿瘤作用；机制层面，该效应与促使巨噬细胞向促炎M1表型极化、抑制CCL2‑CCR2信号轴有关。体外实验进一步表明，氢气可直接抑制肺癌细胞存活与迁移，并下调CCL2‑CCR2通路关键分子，作用效果与CCR2抑制剂类似。上述结果提示：氢气治疗通过调控肿瘤免疫微环境、抑制血管生成，进而抑制肿瘤生长。综上，氢气有望成为一种具有前景的肺癌新型治疗策略。

Hydrogen suppressed tumor growth during chronic intermittent hypoxia via modulating macrophage polarization

 引言

近年来，肺癌持续位居全球肿瘤死亡首要病因，对公共卫生造成沉重负担1。肺癌术后生存率显著低于很多常见恶性肿瘤，部分原因在于围手术期放化疗难以有效清除微转移病灶2⁻3。气体疗法作为肿瘤治疗的新策略，近年备受关注⁴⁻⁵。一氧化氮（NO）、一氧化碳（CO）、硫化氢（H₂S）等多种气体均具备抗肿瘤活性，氢气也拥有与之相当的抗肿瘤作用与机制。尤为重要的是，氢气不会与血液中血红蛋白结合，因此可避免由此带来的毒性损伤。大量动物实验证实氢气干预具备良好安全性⁵⁻⁶。

氢气分子量小，可直接穿透细胞膜扩散进入组织，兼具抗氧化、抗炎、抗凋亡活性⁷；还可间接调控基因表达，发挥抗肿瘤效应⁸。一项纳入82例晚期肿瘤的临床研究证实吸入氢气具备抗肿瘤效果⁹。另有研究发现，富氢水可以缓解吉非替尼、萘酚所致体重下降，提升总体生存率1⁰。针对Ⅳ期结肠癌患者的临床研究显示，吸入氢气可降低外周血CD8⁺T细胞程序性死亡受体‑1（PD‑1）表达，减轻CD8⁺T细胞耗竭，改善患者预后11。还有临床研究报道，非小细胞肺癌患者持续两周吸入氢气，可显著改善免疫衰老⁹。

炎症是小鼠模型与人类肿瘤发生的重要驱动因素12。肿瘤微环境（TME）中的巨噬细胞称为肿瘤相关巨噬细胞（TAMs），具备表型可塑性与异质性。在肿瘤不同发展阶段，肿瘤相关巨噬细胞可响应微环境信号，发生表型极化，在促炎M1样表型与抗炎M2样表型之间转换13⁻1⁶。缺氧与肿瘤不良预后密切相关，肿瘤发生过程中缺氧通路常处于激活状态1⁷。本课题组前期研究表明，慢性间歇性缺氧促进肺癌进展与炎症应答密切相关1⁸；肺癌小鼠模型中，慢性间歇性缺氧诱导的肿瘤相关巨噬细胞表型改变与肿瘤不良预后相关1⁹。趋化因子CC基序配体2（CCL2）在招募肿瘤相关巨噬细胞过程中起到关键作用2⁰。肿瘤转移阶段，CCL2招募CCR2⁺炎症单核细胞以及分化后的巨噬细胞，激活细胞内趋化因子级联反应，显著促进肿瘤转移21⁻22。氢气是否可以通过调控巨噬细胞极化，缓解慢性间歇性缺氧诱导的肿瘤生长，目前尚无相关报道。因此本研究提出假说：氢气通过CCL2‑CCR2轴调控巨噬细胞极化，进而抑制慢性间歇性缺氧驱动的肿瘤生长，并开展实验验证。

 结果

氢气改善慢性间歇性缺氧小鼠的机体状态

首先评估氢气对慢性间歇性缺氧荷瘤小鼠的作用。图1A为动物模型实验流程。慢性间歇性缺氧暴露21天后，与正常对照组（CON）相比，CIH组小鼠摄食量下降；氢气组、顺铂组小鼠摄食量得到改善，其中氢气组改善更为明显（图1B）。CIH处理使小鼠饮水量上升，氢气组、顺铂组可逆转该改变（图1C）。相较于CON组，CIH组小鼠体重下降，氢气干预后小鼠体重回升（图1D）。CIH环境下肿瘤体积、肿瘤重量显著增大；而氢气组、顺铂组肿瘤体积与重量明显降低（图1E‑F）。旷场实验（OFT）结果：CIH组小鼠在中央区域活动时间更短、运动总距离更短；氢气组小鼠自发活动能力得到改善（图1G‑I）。综上，氢气可改善慢性间歇性缺氧暴露小鼠的生理状态，并抑制肿瘤增殖。

> 图1 氢气改善慢性间歇性缺氧小鼠的机体状态

> (A)动物实验模型示意图；(B)荷瘤小鼠摄食量；(C)荷瘤小鼠饮水量；(D)小鼠体重；(E)各组肿瘤代表性照片；(F)肿瘤重量；(G)旷场实验小鼠运动轨迹代表图；(H)中央区域运动距离占总距离百分比；(I)中央区域停留时间占总时间百分比。数据以均值±标准误表示（n=6）。*p＜0.05，**p＜0.01，与CON组比较；#p＜0.05，p＜0.01，与CIH组比较。

氢气抑制慢性间歇性缺氧小鼠肿瘤增殖与血管生成

为进一步解析氢气抑制肿瘤增殖的机制，开展免疫组化（IHC）与Western blot检测。免疫组化结果：CIH组肿瘤增殖标志物Ki67表达显著升高；氢气或者顺铂干预，可缓解CIH诱导的Ki67上调（图2A‑B）。Western blot检测增殖相关关键蛋白：基质金属蛋白酶9（MMP9）、基质金属蛋白酶2（MMP2）、血管内皮生长因子A（VEGF‑A）。相较于CON组，CIH组上述三种蛋白表达均上调；氢气、顺铂处理均可抑制上述蛋白升高（图2C‑F）。以上证据表明，氢气可抑制慢性间歇性缺氧介导的肿瘤增殖，发挥保护作用。

> 图2 氢气抑制慢性间歇性缺氧小鼠肿瘤增殖和血管生成

> (A)小鼠肿瘤组织Ki67免疫组化染色（n=3，比例尺500 μm或100 μm）；(B)Ki67阳性细胞统计；(C‑F)MMP9、MMP2、VEGF‑A蛋白Western blot结果及统计（n=6）。数据以均值±标准误表示。*p＜0.05，**p＜0.01，与CON组比较；#p＜0.05，p＜0.01，与CIH组比较。

氢气调控慢性间歇性缺氧小鼠体内巨噬细胞极化

进一步观察慢性间歇性缺氧条件下肿瘤免疫微环境。采用巨噬细胞标记物F4/80评估巨噬细胞浸润情况。免疫荧光结果：与CON组相比，CIH组M1标志物诱导型一氧化氮合酶（iNOS）降低，M2标志物甘露糖受体CD206升高（图3A‑B）；氢气或顺铂干预后，iNOS、CD206表达趋向恢复正常水平（图3A‑B）。免疫组化结果显示：CIH组促炎因子白介素‑6（IL‑6）、白介素‑1β（IL‑1β）、肿瘤坏死因子‑α（TNF‑α）下调；抗炎因子白介素‑4（IL‑4）、白介素‑10（IL‑10）、转化生长因子‑β（TGF‑β）上调（图3C‑D）。氢气、顺铂干预可逆转该变化：促炎因子升高、抗炎因子降低（图3C‑D）。Western blot结果显示：CIH小鼠免疫检查点分子PD‑1、程序性死亡配体‑1（PD‑L1）蛋白表达升高；氢气、顺铂处理可抑制二者上调（图3E‑G）。综上，氢气可改善慢性间歇性缺氧造成的肿瘤免疫微环境紊乱。

> 图3 氢气调控慢性间歇性缺氧小鼠巨噬细胞极化

> (A,B)F4/80⁺iNOS⁺、F4/80⁺CD206⁺细胞免疫荧光代表图（n=3，比例尺500 μm）；(C,D)IL‑6、IL‑1β、TNF‑α、IL‑4、IL‑10、TGF‑β免疫组化染色（n=3，比例尺500 μm）；(E‑G)PD‑1、PD‑L1蛋白Western blot与统计（n=6）。数据以均值±标准误表示。**p＜0.01，与CON组比较；#p＜0.05，p＜0.01，与CIH组比较。

 CCL2‑CCR2介导肺癌发生发展

利用肿瘤基因组图谱（TCGA）数据库分析CCL2在各亚型肺癌（肺鳞癌LUSC、肺腺癌LUAD、小细胞肺癌SCLC）中的表达。与正常组织相比，肺鳞癌、小细胞肺癌CCL2表达上调（图4A）；肺鳞癌、肺腺癌患者中，CCL2高表达对应更差的生存预后（图4B）。CCL2通过免疫细胞浸润参与肺癌发生发展（图4C）。CCR2在肺鳞癌、肺腺癌中表达同样升高，且与不良生存预后相关，参与肺癌进展（图4D‑F）。Western blot结果：对比CON组，CIH组CCL2、CCR2蛋白表达上升；氢气、顺铂干预可下调二者高表达（图4G‑I）。提示氢气可能通过调控CCL2‑CCR2信号通路参与肿瘤进程。

> 图4 CCL2‑CCR2介导肺癌发生发展

> (A‑C)NCBI、TCGA、GEO数据库中CCL2在肺癌、正常组织的表达、患者生存曲线以及免疫细胞浸润情况；(D‑F)NCBI、TCGA、GEO数据库中CCR2在肺癌、正常组织的表达、患者生存曲线以及免疫细胞浸润情况；(G‑I)CCL2、CCR2蛋白Western blot检测与统计（n=6）。数据以均值±标准误表示。**p＜0.01，与CON组比较；#p＜0.05，p＜0.01，与CIH组比较。

氢气通过CCL2‑CCR2信号通路发挥抑瘤作用

为明确CCL2‑CCR2轴是否介导氢气的保护效应，使用CCR2拮抗剂HY‑108323进行药物阻断实验。CCK‑8细胞活力实验证实50 μM的HY‑108323可以有效抑制RAW264.7巨噬细胞以及Lewis肺癌（LLC）细胞增殖（图5A‑B）。划痕愈合实验结果：间歇性缺氧（IH）可促进细胞迁移；HY‑108323或者氢气处理均可显著削弱该促迁移表型（图5C）。流式细胞免疫分型：IH刺激促使巨噬细胞发生表型转换——M1标志物iNOS下降，M2标志物CD206升高；HY‑108323或氢气干预可以逆转该极化改变（图5D‑E）。Western blot结果：IH诱导CCL2、CCR2、PD‑1、PD‑L1、VEGF‑A、MMP2等通路及效应蛋白上调；HY‑108323、氢气处理均可抑制上述蛋白升高（图5F‑L）。多组实验证据共同证实：氢气的抗肿瘤效应依赖CCL2‑CCR2信号通路。

> 图5 氢气经由CCL2‑CCR2信号通路发挥抑瘤效应

> (A,B)CCK‑8检测RAW264.7、LLC细胞活力；(C)划痕愈合实验检测细胞迁移；(D,E)流式细胞术检测M1标志物iNOS、M2标志物CD206表达（n=3）；(F‑L)CCL2、CCR2、PD‑1、PD‑L1、VEGF‑A、MMP2蛋白Western blot及定量统计（n=6）。数据以均值±标准误表示。**p＜0.01，与CON组比较；#p＜0.05，p＜0.01，与IH组比较。

 讨论

肺癌是全球发病率最高、肿瘤死亡首位的恶性肿瘤，未来数十年，其死亡率预计将远超胃癌、乳腺癌23⁻2⁵。大部分患者确诊时已处于晚期，且对常规治疗存在耐药。目前治疗手段包含手术、放疗、化疗、免疫治疗、生物治疗，但总体生存仍不理想2⁶。临床研究发现，非小细胞肺癌患者持续两周吸入氢气，可显著改善机体免疫功能⁹。肿瘤扩张、细胞外基质（ECM）沉积会造成缺氧‑复氧循环，促进新生血管生成，之后又可出现血管破坏2⁷⁻2⁸。已有小鼠原发肺癌模型证实，慢性间歇性缺氧能够促进血管生成，并诱导肿瘤干细胞样表型2⁹⁻3⁰。本研究证实，氢气干预可以减轻慢性间歇性缺氧诱导的肿瘤增殖，并改变肿瘤相关巨噬细胞极化状态。慢性间歇性缺氧会促进非小细胞肺癌产生耐药、细胞增殖、迁移与侵袭31；另有报道显示，慢性间歇性缺氧可加速黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌等多种肿瘤的生长、迁移与转移32⁻3⁶。和上述文献结果一致：本实验中小鼠接受21天慢性间歇性缺氧暴露，肿瘤体积增大，同时出现肝转移增加。

Ki‑67染色提示CIH组肿瘤增殖活性升高。VEGF‑A在肿瘤进程中参与血管拟态与血管生成，靶向抑制VEGF‑A能够抑制肿瘤血管新生3⁷⁻3⁹。除血管生成之外，VEGF、MMP2还参与肿瘤细胞增殖、分化、侵袭、转移以及免疫逃逸⁴⁰⁻⁴1。MMP2、MMP9作为关键蛋白酶，促进血管生长，释放VEGF‑A，与肿瘤转移、肿瘤发生密切相关⁴2⁻⁴⁴。

免疫细胞被认为是连接慢性间歇性缺氧与肿瘤发生的重要中间机制3⁰。肺癌小鼠模型中，慢性间歇性缺氧诱导肿瘤相关巨噬细胞改变，和不良预后相关1⁹。作为肿瘤微环境内主要免疫细胞，肿瘤相关巨噬细胞可极化为M1、M2两种表型，在肿瘤进程中发挥双重作用⁴⁵⁻⁴⁷。在肺癌中，肿瘤相关巨噬细胞与肿瘤大小、分化、浸润深度、淋巴结转移、TNM分期显著相关⁴⁸。巨噬细胞可提升肿瘤细胞运动、侵袭、外渗能力，促进血管生成，介导免疫抑制以及化疗耐药，进而推动转移⁴⁹⁻⁵1。转移相关巨噬细胞和原发灶肿瘤相关巨噬细胞表型不同，表达炎症单核细胞、巨噬细胞以及CCR2相关标志物21,⁵2。巨噬细胞还通过分泌因子和其他细胞互作，协调炎症反应或者稳态应答⁵3。

M1型巨噬细胞分泌TNF‑α、IL‑1β、IL‑12、IL‑23等促炎细胞因子⁵⁴⁻⁵⁵；M2型巨噬细胞分泌IL‑10、TGF‑β等抗炎细胞因子⁵⁶。肿瘤相关炎症显著推动疾病进展1⁷。例如IL‑4上调CCR1、CCL2、CCL3，促进单核‑巨噬细胞募集与功能活化⁵⁷⁻⁵⁸。炎症、生长因子、iNOS这类DNA损伤因子相互作用，进一步升高肿瘤发生、进展风险⁵⁹。而肿瘤微环境中的肿瘤细胞直接调控肿瘤相关巨噬细胞极化表型⁶⁰。巨噬细胞极化状态决定其功能：M1表型发挥抗肿瘤作用，是患者生存的有利预后标志物1⁷,⁶⁰⁻⁶1；M2型肿瘤相关巨噬细胞通过成纤维细胞生长因子（FGF）、TGF‑β、表皮生长因子（EGF）等促分裂因子刺激肿瘤增殖，促进血管生成，推动肿瘤进展⁶2⁻⁶3。缺氧环境会放大该促血管生成效应：肿瘤相关巨噬细胞分泌VEGFA，趋化细胞迁移，上调MMP9，造成细胞外基质降解，释放活性VEGF‑A⁶3；其中TGF‑β在血管生成中处于核心地位，临床与肿瘤侵袭性密切相关⁶⁴。有文献报道富氢水干预可促使巨噬细胞向促肿瘤M2表型极化，说明该轴具备可干预性⁶⁵。

CCL2，又名单核细胞趋化蛋白‑1（MCP‑1），是调控免疫细胞募集与激活的关键趋化因子⁶⁶。原发肿瘤、转移瘤普遍存在CCL2高分泌现象。在乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌、黑色素瘤、胃癌、卵巢癌等多种肿瘤中，CCL2‑CCR2通路激活和肿瘤进展、转移高度相关⁶⁷。机制上该通路招募单核/巨噬细胞、调节性T细胞等免疫抑制细胞，促进CCR2⁺肿瘤细胞存活、增殖与侵袭⁶⁸⁻⁶⁹；CCL2还可以上调MMP2、MMP9直接增强肿瘤细胞侵袭能力⁶⁹。功能实验证实沉默CCL2，能够抑制原发瘤生长、肺转移、肿瘤干细胞更新、免疫抑制巨噬细胞募集⁷⁰；临床生信分析同样发现CCL2高表达在多种肿瘤提示不良预后，印证其在肿瘤相关巨噬细胞募集中的作用。

近年来，氢气成为生物医学领域备受关注的医用气体分子，肿瘤治疗方向的研究越来越多⁷1。氢气通过调控炎症，有望预防肿瘤发生发展，同时减轻放化疗副作用⁷2；还可以直接作用于肿瘤细胞周期：抑制周期蛋白D1、CDK4、CDK6等关键调控分子，诱导多种细胞系G2/M周期阻滞⁷3；靶向肿瘤干细胞，显著缩小肿瘤体积⁷⁴；通过RhoA/ROCK通路抑制肿瘤细胞迁移，干扰细胞运动必需的细胞骨架重排⁷⁵。肺癌模型中，氢气下调SMC3表达，抑制A549、H1975细胞增殖，缓解疾病进展⁷⁶。另外研究提示氢气可直接增强细胞毒性T细胞等免疫效应细胞活性，强化抗肿瘤免疫应答⁷1,⁷⁴。

转化应用层面：本研究体内动物实验采用氢‑氧混合气体（体积比2:1）。无论动物实验还是临床场景，使用该混合气需要严格工程安全管控：通风、泄漏监测、消除点火源、阻火器、单向阀等安全装置。虽然特定给药系统下该混合气已用于部分临床研究与注册试验⁷⁷，但大范围应用仍需要标准化风险评估与合规审批。

本氢气抗肿瘤预实验仍存在若干局限：抗肿瘤的完整分子机制尚未完全阐明；给药剂量、给药方式等关键参数仍有待优化；实验缺少单纯高氧对照组，因此尚不能完全排除观察到的抑瘤效应部分来自氧气，而并非完全由氢气造成。后续研究将针对上述问题进一步完善。

综上，本研究结果提示：氢气可以抑制慢性间歇性缺氧条件下肿瘤增殖生长，该效应至少部分通过调控巨噬细胞极化实现；氢气有望成为安全有效的肺癌治疗手段。

> 图6 氢气抗肿瘤保护机制示意图

> 慢性间歇性缺氧上调CCL2‑CCR2轴，诱导巨噬细胞向M2型极化，推动肿瘤进展。氢气（H₂）调控该信号轴，抑制M2极化、促进M1极化，进而抑制肿瘤生长。

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