HydroMg通过氢气改善线粒体功能减轻阿霉素诱导的心肌损伤

《Medical Gas Research》，2027年1‑2月，第17卷第1期：30‑39

摘要

氢气本身存在若干固有局限；而HydroMg经过结构优化，可缩短胃肠道转运时间，减少氢气耗散，同时提升细胞生物利用度。但尚不清楚它是否同样具备心脏损伤保护作用。本研究探究缓释氢气供体HydroMg对阿霉素所致心脏损伤的心脏保护效应。体外实验显示：1 μg/mL浓度HydroMg处理，可通过抑制细胞凋亡、减少活性氧生成、恢复线粒体膜电位，减轻阿霉素诱导的心肌细胞死亡。进一步在阿霉素损伤小鼠模型中验证不同剂量HydroMg（20、100、500、1000 mg/kg）的心脏保护效果。100 mg/kg HydroMg组死亡率较单纯阿霉素模型组降低35.7%。同时，相较于单用阿霉素组，HydroMg干预可显著改善心功能，左室射血分数提升12.44%。机制层面：在阿霉素心脏毒性小鼠模型中，HydroMg清除活性氧，实现双重抑制铁死亡与凋亡：上调溶质载体家族7成员11/谷胱甘肽过氧化物酶4（SLC7A11/GPX4）通路抑制铁死亡；下调caspase‑3、上调Bcl‑2抑制凋亡。综上，HydroMg可清除过量活性氧，改善线粒体功能障碍，进而同时抑制铁死亡与凋亡，对抗阿霉素造成的心肌损伤。

引言

阿霉素是一种强效蒽环类抗生素，自20世纪70年代起已用于多种恶性肿瘤的临床治疗1。但其临床应用受限于剂量依赖性心脏毒性，这也是蒽环类化疗最常见、对预后影响最大的不良反应2⁻⁴。值得注意，当阿霉素累积给药剂量超过550 mg/m2时，约26%患者会出现具有临床意义的心脏毒性，限制该药在肿瘤临床中的剂量上限⁵⁻⁷。阐明阿霉素心脏毒性的发病机制，对开发新型心脏保护策略至关重要，亟需机制层面突破以推动靶向治疗发展。

阿霉素诱导心脏毒性涉及线粒体功能障碍（尤其复合体I氧化还原循环）、氧化应激以及多种细胞死亡通路的激活⁸⁻1⁰。该药扰乱线粒体生物发生与电子传递链活性，产生病理性水平的超氧阴离子与活性氧（ROS）；既损害三磷酸腺苷（ATP）合成，又对DNA、蛋白质、脂质膜造成氧化损伤1⁰⁻13。心脏抗氧化系统功能失常，造成过氧化氢、超氧阴离子病理性蓄积1⁴，触发不断自我放大的氧化级联反应。氧化应激叠加钙超载，激活线粒体通透性转换孔1⁵，介导线粒体凋亡、铁死亡1⁶；最终抗氧化防御系统崩溃、膜不可逆去极化，心肌细胞发生死亡1⁰,1⁷。尽管靶向线粒体的治疗手段有望缓解阿霉素心脏毒性，但尚缺乏标准化给药方案，制约临床转化⁹,1⁷。

氢气发挥多重治疗效应，主要依靠三大机制：抗炎、抑制凋亡、清除自由基1⁸,1⁹。现有临床前给药方式包括口服富氢水、吸入氢气、注射富氢生理盐水2⁰。但氢气治疗存在剂量依赖性，需要优化递送系统以最大化治疗收益21。HydroMg是粒径小于200 nm的镁基化合物，可缓释氢气（H₂），减少胃肠道滞留，提升治疗效果。相较于氢气本身的短板，HydroMg经过结构改造，缩短胃肠道转运时间，减少氢气损耗，提高细胞生物利用度。鉴于线粒体功能异常是阿霉素心肌病的核心发病环节，本研究提出假说：HydroMg可通过线粒体保护减轻氧化应激，发挥心脏保护作用。本研究旨在评价其治疗潜力，并围绕氧化还原稳态、程序性细胞死亡阐明作用机制。

材料与方法

 细胞培养

大鼠胚胎来源H9C2成肌细胞（货号ZQ0102，RRID:CVCL_0286）购自上海中乔新舟生物科技有限公司。细胞采用杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）培养，添加10%胎牛血清、100 U/mL青霉素；置于37 ℃、5% CO₂湿润培养箱（赛默飞世尔，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）孵育。

 实验动物

6‑8周龄雄性C57BL/6小鼠，体重22 ± 2 g，购自苏州斯贝福生物科技有限公司。动物在无特定病原体环境适应性饲养7天；环境参数：温度23 ± 1 ℃，湿度50 ± 5%，12小时明暗循环（08:00‑20:00）。全部动物实验遵照《实验动物护理和使用指南》（第8版，2011）22，复旦大学附属中山医院动物伦理委员会批准（伦理编号：ZSYY20240618，审批日期2024‑06‑18）。小鼠随机分为：对照组（n = 8）、阿霉素组（n = 28）、阿霉素+HydroMg 20 mg/kg组（n = 9）、阿霉素+HydroMg 100 mg/kg组（n = 28）、阿霉素+HydroMg 500 mg/kg组（n = 15）、阿霉素+HydroMg 1000 mg/kg组（n = 8）。

 HydroMg与阿霉素给药方案

为评价HydroMg治疗效果，小鼠腹腔注射生理盐水配制的梯度剂量HydroMg（20、100、500、1000 mg/kg）；给药4‑5 h后，腹腔注射阿霉素15 mg/kg造模。每日观察生存状态与一般情况，第6天行终末期心脏超声，之后处死小鼠采集心脏组织。

细胞实验：H9C2心肌细胞生长至70‑80%汇合度，给予梯度浓度HydroMg（0.1、1、10、100、1000 μg/mL）预处理6 h；再给予1 μM阿霉素处理24 h。采用标准化实验检测凋亡与细胞活力。

 死亡率观察

给药后连续6 d每日记录生存情况，每24 h统计各组死亡小鼠数量，记录确切死亡时间。

 心脏超声检测

阿霉素（Sigma‑Aldrich，美国密苏里州圣路易斯）给药第6天，使用Vevo 2100高频超声系统（VisualSonics，加拿大多伦多）评价小鼠心功能。异氟烷麻醉（诱导3%，维持1%；瑞沃德生命科技，中国深圳），采集并分析左心室M型超声图像。

 组织学检测

小鼠腹腔注射70 mg/kg戊巴比妥钠麻醉，取材心脏。4 %多聚甲醛4 ℃浸泡固定24 h；按照标准组织学流程梯度脱水、石蜡包埋，切片厚度5 μm。

切片进行双标记染色：荧光小麦胚芽凝集素染色（赛维尔生物，中国武汉）勾勒心肌细胞膜；原位末端转移酶标记（TUNEL，赛维尔生物）检测程序性细胞死亡。使用荧光显微镜（Leica SR5，德国韦茨拉尔）结合数字图像分析软件完成组织学评价。

 CCK‑8（细胞计数试剂盒‑8）实验

采用CCK‑8试剂盒（碧云天生物技术，中国上海），按标准流程检测细胞活力。简述：对数生长期H9C2细胞胰酶消化，室温187 × g离心5 min，重悬于含10%胎牛血清、1%青霉素‑链霉素的DMEM，接种密度1 × 10⁴个/孔，铺于96孔板；外周孔加入磷酸盐缓冲液（PBS）减少边缘效应。37 ℃、5% CO₂孵育24 h待细胞贴壁；加入新鲜配制不同浓度HydroMg（0.1‑1000 μg/mL完全培养基），分别处理6、12、24 h。每孔原有培养基100 μL，加入10 μL CCK‑8试剂，生理条件孵育1 h。多功能酶标仪（Thermo Scientific Varioskan LUX，美国沃尔瑟姆）每小时检测450 nm吸光度，持续4 h，设置空白孔扣除背景。

 活细胞成像

H9C2心肌细胞接种于6孔板（赛维尔生物），完全DMEM+10%胎牛血清标准培养（37 ℃，5% CO₂）。设置两种处理模式评价HydroMg浓度依赖性活性：①HydroMg持续处理24 h，观察增殖改变；②HydroMg预处理6 h，之后联合1 μM阿霉素共处理24 h，模拟治疗协同效应。使用BioTek Lionheart FX全自动活细胞成像系统（BioTek Instruments，美国温奥斯基）延时成像，定量细胞死亡模式。

 TUNEL（原位末端转移酶标记）实验

采用一步法荧光凋亡检测试剂盒（Annexin V‑FITC/PI，碧云天）检测心肌细胞凋亡；4’,6‑二脒基‑2‑苯基吲哚（DAPI，碧云天）复染细胞核，便于形态学观察。激光共聚焦显微镜双激发通道采集荧光，Z轴层扫保证光学切片精度。

 活性氧（ROS）检测

细胞经1 μg/mL HydroMg、1 μM阿霉素处理后，使用MitoSOX Red线粒体超氧阴离子探针（Invitrogen，美国卡尔斯巴德）染色。5 mM储存液按照1:10 000用培养基稀释为工作液；37 ℃、5% CO₂避光孵育30 min，预热PBS洗涤3次，荧光显微镜观察心肌细胞线粒体ROS水平。

另采用CM‑H2DCFDA试剂盒（碧云天）检测细胞总ROS。探针1:1000稀释（终浓度5 μM），37 ℃避光孵育30 min，共聚焦显微镜采集绿色荧光图像。

 线粒体深红探针（Mitotracker Deep Red）染色

按照说明书使用Mitotracker Deep Red FM（Invitrogen）显示线粒体网络。探针用二甲基亚砜复溶，完全培养基1:10 000稀释得到工作液。H9C2细胞37 ℃、5% CO₂孵育20 min完成染色；‑20 ℃预冷甲醇4 ℃固定10 min，PBS洗涤3次，每次5 min。激光共聚焦显微镜采集高分辨率图像。

 线粒体膜电位检测

采用TMRE（四甲基罗丹明乙酯）荧光检测试剂盒（碧云天）测定线粒体膜电位。储存液1:1000用无血清DMEM配制成1 μM工作液。细胞处理后PBS漂洗；每孔加入1 mL工作液，37 ℃、5% CO₂避光孵育30 min。预热完全培养基洗涤2次，更换新鲜培养基立刻活细胞成像。共聚焦显微镜，激发/发射滤片550 nm/575 nm采集TMRE荧光。

 三磷酸腺苷（ATP）检测

吸弃培养基，冰PBS轻柔洗涤细胞，全部操作冰上进行。6孔板每孔加入200 μL ATP裂解液，反复吹打充分裂解细胞；裂解液转移至预冷1.5 mL离心管，4 ℃ 12 000 × g离心5 min；小心吸取上清（含ATP），避免扰动沉淀。同步使用裂解液/检测稀释液配制梯度ATP标准品绘制标准曲线。ATP检测工作液临用前按说明书稀释（通常1:4），避光。不透光96孔板每孔加入100 μL工作液，室温孵育3‑5 min消耗背景ATP；再加入20 μL样本上清或ATP标准品，吹打或短暂振荡混匀；至少等待2 s，发光检测仪（Thermo Scientific Varioskan LUX）检测相对光单位；全部读数在加样后10‑30 s内完成，各样本保持时间一致。

 蛋白质免疫印迹（Western blot）

心肌细胞、心脏组织采用放射免疫沉淀裂解液（碧云天）提取总蛋白；BCA法（碧云天）测定蛋白浓度。蛋白样本经10%或12.5%十二烷基硫酸钠‑聚丙烯酰胺凝胶电泳分离；湿转系统转印至0.22 μm聚偏二氟乙烯膜（Millipore，美国伯灵顿）。5%牛血清白蛋白‑含吐温20的Tris缓冲盐水室温封闭1 h；4 ℃一抗孵育过夜：

Caspase‑3（兔，1:1000，Cell Signaling Technology，货号9662S）、Bcl‑2（兔，1:1000，货号15071）、TOM20（线粒体外膜转位酶20，兔，1:1000，货号42406）、GPX4（谷胱甘肽过氧化物酶4，小鼠，1:5000，Proteintech，货号67763）、SLC7A11（溶质载体家族7成员11，兔，1:2000，Proteintech，货号26864）、总氧化磷酸化复合体（啮齿类，1:250，Abcam，货号ab110413）；辣根过氧化物酶标记β‑肌动蛋白内参（小鼠，1:5000，康辰，货号KC‑5A08）。

TBST洗涤后，25 ℃孵育辣根过氧化物酶标记二抗1 h（抗小鼠1:5000，Abmart货号M21001S；抗兔1:5000，Abmart货号M21002S）。Bio‑Rad成像系统采集蛋白条带。

 统计学分析

样本量n=8/组参考既往同类研究惯例，未进行正式效能分析。数据采集、分析阶段评价者对分组设盲。GraphPad Prism 9软件统计。定量数据以均值±标准误（mean±SEM）表示；多组比较采用单因素方差分析，差异有统计学意义则Tukey事后多重比较；两组比较采用非配对双尾t检验。生存曲线采用Kaplan‑Meier法绘制，log‑rank检验比较组间生存差异。全部实验至少设置3次独立生物学重复。*P < 0.05*认为差异具有统计学意义。

结果

 HydroMg对心肌细胞活力的影响

为探究HydroMg长时间暴露是否影响心肌细胞生长，活细胞成像动态观察24 h内梯度浓度（0.1、1、10、100、1000 μg/mL）下H9C2细胞增殖（图1A）。结果：1000 μg/mL HydroMg处理24 h可造成大量细胞死亡；而较低浓度（0.1‑100 μg/mL）细胞增殖水平与对照组接近（图1B）。0.1、1、10 μg/mL浓度处理6 h、12 h、24 h，增殖率和对照组无统计学差异（图1C‑E）。

同时CCK‑8检测不同时间点不同浓度HydroMg处理的H9C2细胞活性；结果提示6 h时间点，10、1、0.1 μg/mL HydroMg均可显著提升H9C2细胞活力（图1F‑H）。综上，0.1、1、10 μg/mL浓度HydroMg可提升细胞增殖能力，无明显细胞毒性。

> 图1 HydroMg改善心肌细胞活力

> A：HydroMg处理24 h后活细胞成像定量H9C2细胞死亡（每组n≥3）；1000 μg/mL组大量细胞死亡，低浓度0.1‑100 μg/mL增殖与对照组接近。比例尺：200 μm。

> B：HydroMg处理24 h对H9C2细胞增殖的影响。

> C‑E：HydroMg处理6 h(C)、12 h(D)、24 h(E)，H9C2细胞相对增殖率（每组n≥3）。

> F‑H：H9C2细胞分别给予10、1、0.1 μg/mL HydroMg处理6 h(F)、12 h(G)、24 h(H)，CCK‑8检测细胞活力（每组n≥3）。

> 数据：均值±SEM；P < 0.01（单因素方差分析+Tukey事后检验）。Ctrl=对照组。

 HydroMg抑制阿霉素诱导的心肌细胞死亡

为评价HydroMg心肌保护，H9C2细胞HydroMg预处理6 h，再给予阿霉素刺激（图2A）。梯度浓度HydroMg（10、1、0.1 μg/mL）预处理6 h，之后1 μM阿霉素干预24 h；延时活细胞成像记录24 h细胞动态（图2B）。HydroMg呈剂量依赖性保护心肌，显著降低阿霉素诱导的细胞死亡（图2C）；其中1 μg/mL HydroMg组较单纯阿霉素组增殖能力提升（图2D）。TUNEL定量结果：阿霉素处理组心肌细胞凋亡指数显著高于对照组；1 μg/mL HydroMg共处理可明显抑制阿霉素诱发的细胞凋亡（图2E、F）。以上说明HydroMg可减轻阿霉素造成的心肌细胞死亡，对阿霉素心肌损伤具备潜在保护作用。

> 图2 HydroMg抑制阿霉素诱导心肌细胞死亡与凋亡

> A：实验流程示意图。

> B：H9C2细胞HydroMg预处理6 h，阿霉素处理24 h，活细胞成像实时记录细胞死亡（每组n≥3）；HydroMg剂量依赖性降低阿霉素诱导死亡；1 μg/mL组细胞增殖显著优于单纯阿霉素组。比例尺：200 μm。

> C：6 h HydroMg预处理后，24 h阿霉素干预过程H9C2细胞动态增殖曲线。

> D：6 h HydroMg预处理+24 h阿霉素处理后H9C2相对增殖率。

> E、F：TUNEL染色（绿色）检测各组H9C2细胞凋亡（每组n≥3），比例尺25 μm；1 μg/mL HydroMg显著抑制阿霉素诱导凋亡。

> 数据：均值±SEM；*P < 0.05，P < 0.0001。BF明场；Ctrl对照；DAPI细胞核染料；DOX阿霉素；TUNEL原位凋亡标记。

 HydroMg通过改善线粒体功能、降低氧化应激减轻阿霉素心肌细胞损伤

探究1 μg/mL HydroMg对抗阿霉素凋亡的细胞保护机制，从三项核心指标评价线粒体完整性：形态连续性、线粒体膜电位（ΔΨm）稳态、ATP与ROS生成。Mitotracker Deep Red染色显示：阿霉素处理后H9C2线粒体碎片化明显加重；HydroMg共处理可显著缓解线粒体碎片化（图3A、B）。线粒体膜电位定量提示，阿霉素造成严重膜去极化，HydroMg干预可改善该现象（图3C、D）。阿霉素会降低心肌细胞ATP生成，HydroMg共处理可恢复细胞ATP水平（补充图1），提示线粒体能量功能得到保护。MitoSOX Red荧光检测：阿霉素组线粒体ROS水平显著升高，HydroMg共处理明显抑制该升高（图3E、F）。CM‑H2DCFDA检测总细胞ROS，阿霉素组总ROS显著高于对照组，HydroMg联合干预可显著减弱氧化应激反应（图3G、H）。以上结果证明：HydroMg保护线粒体功能、减轻氧化应激，缓解阿霉素带来的心肌细胞损伤。

> 图3 HydroMg减轻阿霉素诱导的心肌细胞线粒体功能障碍与ROS过量生成

> A：Mitotracker Deep Red染色，荧光显微镜观察H9C2线粒体网络结构（每组n≥3）；阿霉素使线粒体碎片化增加，HydroMg共处理可改善。比例尺：8 μm。

> B：对照组、阿霉素组、阿霉素+HydroMg组线粒体平均长度统计。

> C：TMRE染色检测活H9C2线粒体膜电位（每组n≥3），HydroMg缓解阿霉素诱导线粒体去极化。比例尺：20 μm。

> D：TMRE荧光强度定量。

> E：MitoSOX Red检测H9C2线粒体ROS（每组n≥3）；HydroMg降低阿霉素造成线粒体ROS升高。比例尺：75 μm。

> F：MitoSOX荧光强度统计。

> G：DCFH‑DA染色检测H9C2总ROS（每组n≥3）；HydroMg抑制阿霉素介导总ROS升高。比例尺：25 μm。

> H：DCFH‑DA荧光强度定量。

> 数据：均值±SEM；P < 0.01，*P < 0.001，P < 0.0001。Ctrl对照；DCFH‑DA活性氧探针；DOX阿霉素；ROS活性氧；TMRE线粒体膜电位探针。

 HydroMg改善阿霉素模型小鼠的心功能

在阿霉素心肌损伤小鼠模型中评价HydroMg的预防性心脏保护效果。小鼠腹腔不同剂量HydroMg预处理，4‑5 h后给予阿霉素，构建急性化疗性心肌病模型。每日观察生存，第6天检测心功能（图4A）。阿霉素会升高小鼠死亡率；有意思的是，更高剂量HydroMg（500、1000 mg/kg）联合给药死亡率比单用阿霉素更高；100 mg/kg HydroMg处理，死亡率较单纯阿霉素组下降35.7%（图4B）。100 mg/kg HydroMg可改善左室收缩功能：对比单用阿霉素，左室射血分数升高12.44%，短轴缩短率提升9.66%（图4C‑E，补充图2）。小麦胚芽凝集素染色提示阿霉素造成心肌细胞萎缩，HydroMg共处理可以缓解该改变（图4F、G）。结果证明：100 mg/kg HydroMg可以保护心肌收缩能力，改善生存率，对抗阿霉素心脏毒性。

> 图4 HydroMg改善阿霉素诱导心肌收缩功能损伤

> A：实验流程示意图。6‑8周雄性C57BL/6小鼠，第0天给予阿霉素15 mg/kg；提前4‑5 h腹腔注射HydroMg预处理；连续监测心功能至第6天。

> B：Kaplan‑Meier生存曲线（每组n≥3）。

> C：心脏超声评价心功能；100 mg/kg HydroMg改善心功能，相较单用阿霉素LVEF升高12.44%，FS升高9.66%。

> D：射血分数EF统计；E：短轴缩短率FS统计。

> F：心肌组织切片小麦胚芽凝集素染色代表性图片（每组n≥3），HydroMg缓解阿霉素诱导的心肌细胞萎缩。比例尺：10 μm。

> G：心肌细胞横截面积定量。

> 数据：均值±SEM，单因素方差分析+Tukey多重比较；*P < 0.05，P < 0.01，P < 0.0001。Ctrl对照；DOX阿霉素；EF射血分数；FS短轴缩短率；i.p.腹腔注射；LVEF左室射血分数；WGA小麦胚芽凝集素。

 HydroMg抑制阿霉素模型小鼠心脏凋亡信号通路

为探究体内HydroMg是否调控阿霉素介导凋亡信号通路，对心肌组织进行TUNEL染色。与溶剂对照组相比，阿霉素显著升高心肌细胞凋亡；HydroMg处理可明显抑制凋亡（图5A、B）。机制上，急性模型中阿霉素使心脏组织caspase‑3表达升高，HydroMg干预抑制caspase‑3激活（图5C、D）。抗凋亡蛋白Bcl‑2在阿霉素处理心肌中表达下调，HydroMg给药逆转该变化，Bcl‑2恢复至接近对照组水平（图5C、E）。结果说明HydroMg通过拮抗阿霉素驱动的凋亡级联反应发挥心脏保护，改善心功能。

> 图5 HydroMg减轻阿霉素心肌损伤小鼠的心肌细胞凋亡

> A：心肌组织切片TUNEL染色（每组n≥3）；HydroMg减轻阿霉素诱导心肌凋亡。比例尺：10 μm。

> B：TUNEL阳性心肌细胞定量。

> C：小鼠心肌组织caspase‑3、Bcl‑2蛋白表达的Western blot结果。

> D、E：caspase‑3(D)、Bcl‑2(E)蛋白相对表达统计（每组n = 3）。

> 数据：均值±SEM；P < 0.01，*P < 0.001，P < 0.0001。Ctrl对照；DAPI细胞核染料；DOX阿霉素；TUNEL原位凋亡标记。

 HydroMg改善阿霉素模型小鼠心脏线粒体功能，抑制铁死亡

在动物体内评价HydroMg对阿霉素诱导线粒体损伤的保护效果。小鼠心脏心肌组织Western blot结果：HydroMg处理显著上调线粒体外膜转位酶TOM20的表达（图6A、B），提示线粒体功能改善。检测线粒体呼吸链复合体I‑V蛋白表达水平评价呼吸链完整性：HydroMg可明显逆转阿霉素造成的复合体II、III、V表达下降（图6C、D）。进一步解析HydroMg改善线粒体功能的分子机制，检测铁死亡调控蛋白。Western blot显示：对比对照组，阿霉素显著下调GPX4、SLC7A11表达；HydroMg处理可明显恢复这两个关键铁死亡抑制蛋白的水平（图6E‑H）。综上：HydroMg改善线粒体功能，抑制铁死亡，从而对阿霉素心肌病产生心脏保护效应。

> 图6 HydroMg改善阿霉素诱导线粒体功能障碍并抑制铁死亡

> A、B：小鼠心肌TOM20蛋白Western blot(A)及统计(B)。

> C、D：小鼠心肌复合体I‑V蛋白免疫印迹(C)及统计(D)。

> E、F：SLC7A11蛋白免疫印迹(E)与定量统计(F)。

> G、H：GPX4蛋白免疫印迹(G)与定量统计(H)。

> 数据：均值±SEM（每组n = 3）；*P < 0.05，P < 0.01，*P < 0.001，P < 0.0001。CI复合体I；CII复合体II；CIII复合体III；CIV复合体IV；CV复合体V；Ctrl对照；DOX阿霉素；GPX4谷胱甘肽过氧化物酶4；SLC7A11溶质载体家族7成员11；TOM20线粒体外膜转位酶20。

讨论

线粒体功能障碍被公认为阿霉素心脏毒性的核心病理机制2⁴。本研究证实，阿霉素造成线粒体超微结构损伤与能量代谢异常，带来ROS过量生成、氧化磷酸化受损；这些病理改变相互影响，同时激活凋亡、铁死亡通路，最终导致心肌细胞进行性死亡、心肌收缩功能受损。HydroMg通过稳定线粒体，打断上述阿霉素诱导的病理级联，实现全面的心肌保护。

细胞实验中选用1 μg/mL HydroMg，该浓度在0.1‑10 μg/mL区间内，经过预实验筛选，兼具最优促增殖活性与生物学相关性；可抑制凋亡信号、降低ROS、恢复线粒体膜电位，减轻阿霉素介导心肌细胞死亡；本研究排除100 μg/mL等高浓度，避免脱靶与毒性效应。动物阿霉素模型中，HydroMg干预显著提高生存率，改善心功能；下调caspase‑3抑制凋亡，上调SLC7A11与GPX4抑制铁死亡。本研究结果说明，以线粒体为靶点的HydroMg，提供了基于机制的对抗化疗相关心脏毒性的新策略。

本研究证实HydroMg依靠可控的氢气释放，阻断病理级联，实现抗阿霉素心肌损伤的心脏保护效果。机制上HydroMg协同清除ROS、稳定线粒体，有效减轻氧化应激与凋亡。值得关注：阿霉素会选择性富集于心肌细胞线粒体，造成电子传递链功能异常、氧化磷酸化崩溃，以及钙超载介导的线粒体通透性转换孔激活2⁵⁻2⁷；心磷脂复合体参与线粒体内膜失稳，驱动ROS爆发、线粒体衰竭2⁸,2⁹，进一步诱发凋亡‑铁死亡交互串扰，细胞色素C释放，心肌细胞死亡3⁰,31。当前针对该病理的治疗手段主要包括线粒体靶向醌类、卡维地洛、小檗碱、右雷佐生⁹,32⁻3⁸，维生素3⁹，以及氢气⁴⁰。传统抗氧化剂虽具备活性，但线粒体膜穿透能力有限⁴1,⁴2。氢气虽可进入线粒体，但现有给药方式造成体内生物利用度不足，靶向效果受限⁴3,⁴⁴。与之对比，HydroMg经过分子封装结构优化，减少药物泄漏。

本研究表明HydroMg发挥双重通路抑制效应：一方面下调caspase‑3、上调Bcl‑2抑制凋亡；另一方面稳定SLC7A11/GPX4轴抑制铁死亡，从而更全面阻断细胞死亡。

线粒体来源ROS是阿霉素心脏毒性的关键驱动因素，通过脂质过氧化级联放大铁依赖的铁死亡⁴⁵,⁴⁶。该过程始于阿霉素造成不稳定铁池蓄积⁴⁷；铁催化氧化损伤，消耗SLC7A11/GPX4抗氧化储备⁴⁸,⁴⁹，形成自我放大的氧化还原失衡。脂质过氧化产物进一步促进ROS生成，形成病理环路；叠加线粒体ROS过量，诱发心肌细胞铁死亡——铁介导的独特细胞死亡途径，参与心脏功能进行性恶化1⁷,⁵⁰⁻⁵⁴。本研究结果和Tadokoro等人⁵⁵的报道一致，阿霉素心肌病中凋亡、铁死亡会同时发生；使用凋亡抑制剂zVAD联合铁死亡抑制剂Fer‑1可以大幅减轻心肌细胞死亡，凸显多通路干预的治疗必要性，而单一靶点治疗方案存在固有局限。

本研究存在若干局限性：尚未在慢性阿霉素心肌病模型验证HydroMg疗效；未使用原代心肌细胞开展机制验证；没有采用抑制剂共处理研究铁死亡通路之间的串扰；本研究全部使用雄性小鼠，虽然可以排除动情周期混杂因素，但研究结论外推至雌性存在限制。后续研究将弥补上述不足，在更多疾病阶段、多种实验模型验证HydroMg疗效。

综上，本研究结果表明HydroMg可清除活性氧，重建线粒体稳态，同时抑制凋亡与铁死亡，保护心肌对抗阿霉素心脏损伤，促进心脏功能恢复。

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