吸入氢气通过PTEN诱导激酶1 Parkin通路调控SH-SY5Y细胞和小鼠线粒体自噬减轻脑缺血再灌注损伤

背景

脑缺血/再灌注损伤（CIRI）在脑血流恢复后会造成严重的神经元损伤，线粒体功能障碍是该过程的核心病理驱动因素。氢气（H₂）已在多种神经系统疾病模型中展现出良好的神经保护作用，但氢气是否通过调控线粒体自噬及其上游信号通路来减轻CIRI，目前尚不明确。

方法

体内实验：选用雄性C57BL/6小鼠建立大脑中动脉栓塞/再灌注（MCAO/R）模型，随机分为3组：假手术组、MCAO/R组、MCAO/H₂组。

体外实验：人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞建立氧糖剥夺/复氧（OGD/R）模型，分为4组：对照组、OGD/R组、OGD/R+H₂组、OGD/R+H₂+ML385组（ML385为Nrf2特异性抑制剂，OGD前1h预处理）。

检测指标：神经功能缺损评分（Zea-Longa）、TTC染色测脑梗死体积、HE/尼氏/TUNEL染色评估病理损伤与凋亡、CCK-8测细胞活力、流式细胞术检测细胞凋亡、线粒体活性氧（ROS）、线粒体膜电位（MMP）、Western Blot定量蛋白表达。

 结果

体内实验显示，吸入氢气显著改善MCAO/R小鼠神经功能缺损、减小脑梗死体积、减轻组织病理损伤、抑制神经元凋亡并促进线粒体自噬。

在SH-SY5Y细胞中，氢气处理显著提高细胞活力、减轻氧化应激与线粒体功能障碍，并通过激活PINK1/Parkin通路增强线粒体自噬。

机制上，氢气维持细胞氧化还原稳态、清除受损线粒体、上调Nrf2/HO-1抗氧化通路、抑制NF-κB介导的炎症信号。值得注意的是，使用ML385抑制Nrf2可显著逆转氢气对OGD/R损伤细胞的线粒体保护与抗凋亡作用。

 结论

本研究表明，氢气通过减轻氧化应激、抑制神经元凋亡、改善线粒体功能发挥显著的抗脑缺血/再灌注损伤神经保护作用。这些效应与激活Nrf2/PINK1/Parkin介导线粒体自噬通路密切相关，提示氢气可作为治疗脑缺血/再灌注损伤的潜在方法。

引言

缺血性卒中是全球性公共卫生难题，具有高发病率、高死亡率和高致残率，尤以老年人群最为突出。脑缺血缺氧后，神经元与神经血管单元发生进行性结构和功能损伤。尽快实现闭塞脑血管再通、恢复血流灌注，是挽救缺血半暗带存活神经元的主要临床策略。然而，再灌注过程常引发继发性病理损伤，即脑缺血/再灌注损伤，进一步加重神经功能缺损并降低血管再通治疗效果。

脑缺血/再灌注损伤的发病机制极为复杂，涉及过度氧化应激、炎症反应激活、线粒体功能障碍、凋亡信号级联反应及自噬紊乱等。越来越多的证据证实，过度氧化应激及其继发的线粒体损伤是脑缺血/再灌注损伤发生发展的核心环节。过量活性氧直接激活核因子κB炎症通路，破坏线粒体膜完整性，降低线粒体膜电位，触发内源性凋亡通路，最终导致大量神经元死亡。线粒体是维持细胞能量代谢与氧化还原稳态的关键细胞器，其功能障碍与脑缺血/再灌注损伤的发生密切相关。线粒体自噬是一种选择性自噬，可特异性靶向清除受损线粒体，维持线粒体质量控制与细胞稳态。通过线粒体自噬高效清除受损线粒体，被认为是减轻脑缺血/再灌注损伤的关键治疗靶点。PTEN诱导激酶1（PINK1）/Parkin通路是介导线粒体自噬的经典且研究最为透彻的信号轴。

已有研究证实，核因子E2相关因子2（Nrf2）信号通路是抵御氧化应激与线粒体功能障碍的重要细胞防御机制。Nrf2核内高表达可促进下游抗氧化酶的转录生成，包括血红素氧合酶1（HO-1）、NAD(P)H醌氧化还原酶1（NQO1）和超氧化物歧化酶（SOD），从而减轻氧化损伤并维持线粒体功能。Nrf2与核因子κB的交互作用，共同调控脑缺血损伤中抗氧化反应与炎症进程的平衡，使Nrf2成为脑缺血/再灌注损伤的潜在治疗靶点。

氢气（H₂）是分子量最小且生物学惰性的双原子分子，因其生物安全性好、高透膜性（可透过血脑屏障）及选择性抗氧化特性，成为转化医学领域新型治疗气体。既往研究已证实氢气在脑缺血/再灌注损伤模型中的神经保护作用，但其分子机制尚未完全阐明，尤其是氢气、Nrf2信号与PINK1/Parkin介导线粒体自噬之间的调控关系仍不明确。尽管已有文献报道氢气在脑缺血中的抗氧化与抗凋亡作用，但尚无研究在体内外脑缺血/再灌注损伤模型中系统验证Nrf2-PINK1/Parkin-线粒体自噬这一连续调控轴。

本研究旨在探讨吸入氢气对脑缺血/再灌注损伤的神经保护作用，并揭示其可能通过Nrf2/PINK1/Parkin通路介导线粒体自噬的分子机制，为氢气用于缺血性卒中临床治疗提供新的实验依据。

材料与方法

实验动物

SPF级雄性C57BL/6成年小鼠，体重25±2 g，购自辽宁长生生物技术有限公司（许可证号：SCXK（辽）2020-016）。小鼠饲养于温度22±2℃、湿度55±5%、12 h明暗交替环境，自由摄食饮水，适应性饲养3天后开始实验。采用随机数字表法将小鼠分为3组（每组n=12，共40只）；纳入标准为MCAO造模成功（术后神经功能缺损评分≥1分）、体重23–27 g且术前无异常；因手术失败或过早死亡剔除4只，符合预设纳入排除标准。

所有动物实验经哈尔滨医科大学实验动物伦理委员会批准（批准号：2024-DWSYLLCZ-53），并严格遵循ARRIVE指南执行。

大脑中动脉栓塞/再灌注模型制备与氢气处理

所有手术由同一熟练研究者操作以减少误差。腹腔注射戊巴比妥钠（50 mg/kg）麻醉小鼠，颈正中切口暴露右侧颈总动脉、颈外动脉与颈内动脉，采用硅胶线栓法插入颈内动脉阻断大脑中动脉，缺血2 h后拔线栓实现24 h再灌注。假手术组仅进行相同手术操作但不插入线栓；MCAO/H₂组于再灌注0 h和12 h吸入67%氢气+33%氧气混合气体，流量1.5 L/min，每次3 h，在通风防爆通风橱内进行并实时监测气体浓度确保安全，操作区域无明火及静电源。假手术组与MCAO/R组在相同条件下吸入正常空气。再灌注24 h后，深度麻醉下颈椎脱臼处死小鼠，快速取脑组织用于后续检测。实验设计见图1A。

图1 实验设计流程图

（A）大脑中动脉栓塞/再灌注（MCAO/R）小鼠模型及氢气（H₂）吸入治疗的动物实验设计；（B）SH-SY5Y细胞氧糖剥夺/复氧（OGD/R）模型、氢气处理及Nrf2抑制剂干预的体外实验设计。样本量与统计学详情见相应图注。

细胞培养与氧糖剥夺/复氧模型构建

人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞购自碧云天生物技术公司（C6823），培养于含10%胎牛血清及1%青链霉素双抗的DMEM/F12培养基中，置于37℃、5% CO₂培养箱。构建氧糖剥夺/复氧模型模拟体外脑缺血/再灌注损伤：细胞置于无糖DMEM/F12培养基，放入厌氧培养袋建立厌氧环境（O₂浓度<0.1%，5% CO₂）培养5 h，随后恢复正常培养条件复氧12 h。氢气处理组于复氧期间置于67%氢气+33%氧气混合气体环境。抑制实验于氧糖剥夺前1 h加入5 μM Nrf2特异性抑制剂ML385（溶于二甲基亚砜）。细胞分为4组：正常对照组、氧糖剥夺/复氧组、氧糖剥夺/复氧+氢气组、氧糖剥夺/复氧+氢气+ML385组。设置二甲基亚砜溶剂对照组排除溶剂干扰。实验设计见图1B。

神经功能缺损评分

再灌注24 h后，由两名独立盲法评估者采用Zea-Longa 5分制评分法评估神经功能缺损：0分=无神经功能缺损；1分=对侧前肢不能完全伸展；2分=向对侧转圈；3分=向对侧倾倒；4分=无自主活动且意识抑制。

脑梗死体积检测

新鲜脑组织于-80℃冷冻5 min，冠状切为2 mm厚度切片，2% 2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC）37℃避光染色20–30 min，4%多聚甲醛固定24 h后拍照，采用ImageJ软件定量梗死体积，以损伤区域占全脑体积百分比表示。

组织病理与凋亡分析

脑组织固定、脱水、石蜡包埋后制作4 μm切片，行HE染色与尼氏染色观察神经元形态损伤与尼氏体完整性；TUNEL凋亡检测试剂盒检测神经元凋亡，盲法评估者于光学显微镜200倍下计数TUNEL阳性细胞。

细胞活力、活性氧与线粒体膜电位检测

采用CCK-8试剂盒于450 nm处检测细胞活力，计算公式：细胞存活率=100%×（实验组OD值-空白组OD值）/（对照组OD值-空白组OD值）。DCFH-DA荧光探针试剂盒结合流式细胞术检测线粒体活性氧水平；JC-10试剂盒结合流式细胞术检测线粒体膜电位，评估线粒体膜完整性。所有体外实验至少进行3次独立生物学重复。

蛋白质印迹法

含苯甲基磺酰氟的RIPA裂解液提取细胞与脑组织总蛋白，BCA试剂盒定量蛋白浓度。取20 μg蛋白经10%–12.5% SDS-PAGE电泳分离，转印至硝酸纤维素膜，5%脱脂牛奶封闭，4℃孵育一抗：微管相关蛋白轻链3（LC3）、PINK1、Parkin、Bcl-2、Bax、Caspase-3、Nrf2、血红素氧合酶1（HO-1）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH），随后孵育辣根过氧化物酶标记二抗，化学发光成像系统显影，ImageJ软件分析条带灰度值。

统计学分析

所有实验数据采用GraphPad Prism 9.0软件分析，以均数±标准差（x±s）表示。两组间比较采用非配对t检验；多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），后续行Tukey事后检验。P<0.05为差异具有统计学意义。生物学重复数（n）标注于各图注中。所有结局评估与数据分析均采用双盲法进行。

 结果

氢气吸入减轻MCAO/R诱导的脑损伤、神经功能缺损与组织病理损伤

为评估氢气对MCAO/R诱导脑损伤的治疗潜力，构建小鼠MCAO模型并给予氢气再灌注治疗24 h。TTC染色显示，与假手术组相比，MCAO/R组脑梗死体积（白色区域）显著增大（P<0.01），而氢气吸入可显著减小MCAO/H₂组梗死体积（P<0.01）（图2A、2B）。MCAO/R组Zea-Longa评分显著高于假手术组（P<0.01），氢气治疗可显著改善神经功能（P<0.05）（图2C）。以上结果表明氢气可改善小鼠MCAO/R诱导的脑损伤。

图2 氢气吸入减轻MCAO/R诱导的脑损伤、神经功能缺损与组织病理损伤

（A、B）各组脑缺血24 h后冠状位TTC染色代表性图像与脑梗死体积定量分析（n=3）；（C）各组神经功能缺损评分（Zea-Longa评分，n=3）；（D、E）各组缺血皮层与海马区组织病理改变的HE染色与尼氏染色代表性图像（n=3；放大倍数×200，标尺10 μm）。数据以均数±标准差表示。*P<0.05，P<0.01，MCAO/R组与假手术组或MCAO/H₂组比较。

HE与尼氏染色评估神经元组织病理改变。HE染色显示，MCAO/R组出现严重神经元坏死、水肿与结构紊乱，而MCAO/H₂组组织病理损伤显著缓解，神经元形态接近正常（图2D）。尼氏染色显示，MCAO/R组尼氏体大量丢失，氢气治疗可显著恢复尼氏体水平（图2E）。上述结果证实，氢气吸入可有效缓解MCAO/R诱导的脑损伤。

氢气提高SH-SY5Y细胞活力并减轻OGD/R诱导的氧化应激与线粒体损伤

体外进一步验证氢气对脑缺血/再灌注损伤的神经保护作用。缺氧处理后采用CCK-8法检测细胞活力。结果显示，氧糖剥夺/复氧处理使SH-SY5Y细胞活力显著降至34.5±4.45%（P<0.01，与对照组相比），而氢气治疗使细胞活力恢复至68.00±3.08%（P<0.05，与氧糖剥夺/复氧组相比）（图3A）。

 图3. 氢气提高SH‑SY5Y细胞活力，减轻氧糖剥夺/复氧诱导的氧化应激与线粒体损伤

(A) CCK‑8法检测SH‑SY5Y细胞活力。(B、C)流式细胞术检测细胞内活性氧（ROS）水平的代表性荧光图与定量分析，对SH‑SY5Y细胞荧光强度进行定量。(D、E)流式细胞术检测线粒体膜电位（MMP）的JC‑10染色代表性图像，低膜电位以统计直方图展示。数据以均数±标准差表示，来自三次独立实验（每组n=3）。*P<0.05，P<0.01，OGD/R组与空白对照组或OGD/R+H₂组比较。

随后检测多项氧化应激与线粒体功能相关标志物，进一步证实氢气的保护作用。流式结果显示，OGD/R显著升高线粒体ROS水平（P<0.05），而氢气处理可使其明显降低（P<0.05）（图3B、C）。OGD/R导致线粒体膜电位显著下降（绿色荧光增强），氢气处理则维持膜电位并使红色荧光增强（P<0.05）（图3D、E）。以上结果表明，氢气可有效抑制OGD/R损伤神经元的氧化应激并改善线粒体功能。

 氢气在MCAO/R小鼠中激活Nrf2/HO‑1通路并抑制NF‑κB信号

Nrf2是关键的氧化还原敏感转录因子，可调控多种抗氧化防御基因（如HO‑1）表达，以抵御氧化应激损伤与线粒体功能障碍。为明确Nrf2通路是否参与氢气的神经保护作用，采用蛋白质印迹法检测Nrf2及其下游抗氧化酶HO‑1的表达。

结果显示，MCAO/R组Nrf2与HO‑1蛋白表达上调（P<0.01，与假手术组比），氢气处理可进一步显著升高二者表达（P<0.05、P<0.01，与MCAO/R组比）（图4A、B）。

 图4. 氢气在MCAO/R小鼠中激活Nrf2/HO‑1通路并抑制NF‑κB信号

蛋白质印迹法检测并统计Nrf2（A）、HO‑1（B）及细胞核NF‑κB（C）蛋白表达水平。数据以均数±标准差表示（每组n=3）。*P<0.05，P<0.01，MCAO/R组与假手术组或MCAO/H₂组比较。

既往研究表明，ROS可通过促进IκBα磷酸化激活NF‑κB，进而调控细胞NF‑κB信号通路活性。为探究氢气吸入是否影响NF‑κB活化，检测NF‑κB p65亚基的核转位。氢气处理可显著抑制MCAO/R诱导的NF‑κB p65核转位（P<0.01），提示其抑制NF‑κB介导的炎症信号（图4C）。上述结果证实，氢气通过激活Nrf2/HO‑1通路发挥抗氧化与抗炎作用。

 氢气增强MCAO/R小鼠PINK1/Parkin介导线粒体自噬并抑制神经元凋亡

为探究线粒体自噬在氢气神经保护中的作用，检测关键线粒体自噬相关因子的蛋白表达。MCAO/R组线粒体自噬相关蛋白PINK1、Parkin及LC3‑II/LC3‑I比值升高（P<0.01、P<0.05），氢气处理可进一步显著升高（P<0.01、P<0.05），提示线粒体自噬增强（图5A‑5C）。TUNEL染色显示，MCAO/R组凋亡神经元显著增多（P<0.001，与假手术组比），氢气可使其明显减少（P<0.01）（图6A、6B）。蛋白质印迹显示，氢气显著下调促凋亡蛋白Bax、Caspase‑3，上调抗凋亡蛋白Bcl‑2（P<0.05或P<0.001，与MCAO/R组比）（图6C‑6E）。

 图5. 氢气增强MCAO/R小鼠PINK1/Parkin介导线粒体自噬

代表性蛋白质印迹条带与定量分析：PINK1（A）、Parkin（B）、LC3‑II/I（C）。数据以均数±标准差表示（每组n=3）。*P<0.05，P<0.01，*P<0.001，MCAO/R组与假手术组或MCAO/H₂组比较。

 图6. 氢气吸入通过抑制神经元凋亡对MCAO/R小鼠发挥神经保护作用

(A、B)缺血侧海马区TUNEL染色代表性图像（放大倍数×200，标尺10μm）及TUNEL阳性凋亡细胞定量分析（每组n=3）。缺血脑组织中Bax（C）、Caspase‑3（D）、Bcl‑2（E）蛋白表达的代表性印迹与定量结果（每组n=3）。数据以均数±标准差表示。*P<0.05，P<0.01，*P<0.001，MCAO/R组与假手术组或MCAO/H₂组比较。

 Nrf2抑制剂ML385逆转氢气对OGD/R损伤SH‑SY5Y细胞的神经保护作用

为进一步验证Nrf2参与氢气的神经保护作用，使用Nrf2特异性抑制剂ML385，体外检测线粒体自噬与凋亡相关标志物蛋白表达。ML385预处理可显著逆转氢气诱导的OGD/R细胞PINK1、Parkin上调及LC3‑II/LC3‑I比值升高（P<0.01，与OGD/R+H₂组比）（图7A‑7C）。ML385还阻断氢气的抗凋亡作用，使Bax、Caspase‑3表达回升、Bcl‑2表达下降（P<0.05，与OGD/R+H₂组比）（图7D‑7F）。以上结果证实，Nrf2信号是氢气诱导线粒体自噬与神经保护的关键上游介质。

 图7. Nrf2抑制剂ML385逆转氢气对OGD/R损伤SH‑SY5Y细胞的神经保护作用

代表性蛋白质印迹条带与定量分析：PINK1（A）、Parkin（B）、LC3‑II/I（C）、Bax（D）、Caspase‑3（E）、Bcl‑2（F）。数据以均数±标准差表示，来自三次独立实验（每组n=3）。*P<0.05，P<0.01，*P<0.001，OGD/R组与空白对照组、OGD/R+H₂组，以及OGD/R+H₂组与OGD/R+H₂+ML385组比较。

细胞实验中，Nrf2抑制剂ML385实验加入DMSO溶剂对照组以进行严格对照分析，结果显示ML385显著抑制线粒体自噬（补充图1）。

综上所述，氢气吸入可显著减轻体内外MCAO/R与OGD/R诱导的神经元损伤，其机制部分依赖激活Nrf2/HO‑1通路并维持线粒体稳态（图8）。

图8. 氢气抗脑缺血再灌注损伤神经保护机制模式图

氢气干预促进Nrf2核转位，抑制过量ROS生成，增强PINK1/Parkin介导线粒体自噬。上述效应共同改善线粒体功能、抑制神经元凋亡，最终减轻脑缺血再灌注损伤与神经功能缺损。

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讨论

缺血性卒中是全球长期致残的主要原因，脑缺血再灌注损伤（CIRI）仍是临床有效再通治疗的主要障碍。线粒体功能障碍与过度氧化应激是CIRI核心病理机制，靶向调控线粒体自噬以维持线粒体稳态已成为极具前景的治疗策略。线粒体自噬可选择性清除受损线粒体，避免ROS堆积与凋亡信号激活，对缺血再灌注后神经元存活至关重要。

氢气因生物安全性高、可透过血脑屏障、具有选择性抗氧化能力，在神经领域研究中备受关注，但其抗CIRI的精确机制尚未完全阐明。氢气不仅可选择性清除内源性毒性ROS，还可作为细胞内信号分子与缓冲剂。自2007年发现氢气对脑缺血再灌注损伤具有神经保护作用以来，越来越多临床前证据证实其可抑制神经元凋亡、减轻氧化应激。

本研究证实，氢气吸入可在体内MCAO/R小鼠与体外OGD/R神经元模型中有效缓解CIRI，减小脑梗死体积、改善神经功能、抑制氧化应激与神经元凋亡、增强线粒体功能。本研究的创新点在于：证实Nrf2/PINK1/Parkin通路是氢气促进线粒体自噬的关键调控轴，这在既往氢气神经保护研究中尚未得到系统验证。

MCAO模型是CIRI研究的常用模型，可稳定产生可靠的梗死体积，使实验动物出现中度脑损伤。为排除激素干扰，所有体内实验均采用雄性小鼠，因雌性雌激素、孕激素等周期性波动可影响线粒体功能与自噬流，产生固有神经保护作用，可能掩盖氢气效果。TTC染色是评估脑缺血损伤药物疗效的金标准，MCAO/R组梗死体积稳定在约40%，证实模型构建成功；氢气治疗后梗死体积与神经功能评分显著改善。组织学（HE、尼氏染色）进一步证实，氢气可显著缓解CIRI所致病理损伤，包括皮层与海马神经元丢失、尼氏体耗竭、排列紊乱、核固缩与空泡化。

机制上，本研究拓展既往发现：氢气通过激活Nrf2通路发挥抗氧化作用，上调下游抗氧化酶HO‑1，并通过PINK1/Parkin信号级联增强线粒体自噬，揭示氢气神经保护中Nrf2信号与线粒体自噬的全新分子关联。

SH‑SY5Y细胞可模拟神经元形态与生理功能，用于体外机制验证。CCK‑8结果显示，OGD/R显著降低细胞活力，氢气可显著提高存活率；氢气还可显著抑制OGD/R细胞线粒体ROS生成，证实其强抗氧化能力。线粒体膜电位是线粒体结构完整与功能稳定的核心指标，OGD/R 12h后严重受损，氢气可有效维持。以上结果证实，氢气的神经保护作用与改善线粒体功能、减轻氧化损伤密切相关。

转录因子Nrf2通过诱导解毒与抗氧化酶基因表达，成为线粒体功能与细胞氧化还原稳态的重要调控因子，广泛参与缺血性卒中进程。氧化应激状态下，Nrf2与胞质抑制蛋白Keap1解离，转入细胞核并结合抗氧化反应元件（ARE），驱动下游保护性基因表达，调控氧化还原平衡、能量代谢与解毒。本研究蛋白质印迹显示，氢气显著提高Nrf2蛋白表达；HO‑1作为Nrf2靶基因，在维持线粒体功能、抑制氧化应激损伤与细胞凋亡中起关键作用。既往研究表明，Nrf2激活可影响线粒体稳态与自噬，可能通过调控HO‑1等下游靶点实现。Nrf2特异性抑制剂ML385可减弱氢气在SH‑SY5Y细胞中的抗氧化与线粒体保护作用，证实Nrf2通路与氢气缓解CIRI相关。

除直接抗氧化外，Nrf2激活可拮抗线粒体ROS过量生成与脂质过氧化，维持线粒体功能。过量ROS还可通过促进IκBα磷酸化与NF‑κB p65核转位驱动NF‑κB激活，加剧炎症与凋亡级联反应。本研究发现，MCAO/R损伤增强NF‑κB p65核聚集，氢气可显著逆转，提示氢气在CIRI中还具有抗炎作用。

越来越多证据表明，Nrf2可结合PINK1启动子内的ARE序列上调PINK1表达，建立Nrf2信号与PINK1/Parkin介导线粒体自噬的调控关联。本研究中，氢气升高PINK1、Parkin蛋白水平并提高LC3‑II/LC3‑I比值，证实其在OGD/R模型中增强线粒体自噬。重要的是，ML385抑制Nrf2可消除氢气诱导的PINK1/Parkin上调与线粒体自噬激活，证实Nrf2信号是氢气促进线粒体自噬的上游介质。

氧化还原平衡与线粒体完整性是神经元存活与凋亡的核心调控因素。体内TUNEL染色显示，氢气吸入显著减少MCAO/R诱导的皮层与海马神经元凋亡；分子检测进一步显示，氢气上调抗凋亡蛋白Bcl‑2，下调促凋亡蛋白Bax与活化Caspase‑3，恢复Bcl‑2/Bax平衡，该平衡对维持线粒体膜稳定、阻止细胞色素C释放与凋亡级联激活至关重要。ML385同样可消除氢气的抗凋亡作用，证实Nrf2通路激活是氢气抑制CIRI神经元凋亡的必需环节。

本研究存在若干局限性：结论为初步结果，基于雄性小鼠与单一神经元细胞系；氢气吸入虽产生可测量的神经保护作用，但梗死体积与神经功能改善程度中等；需在更大动物模型中开展临床前研究验证。尽管存在局限，本研究仍为氢气作为CIRI潜在治疗手段提供了可靠实验证据。

结论

总之，氢气吸入通过减轻氧化应激、抑制神经元凋亡、恢复线粒体稳态发挥显著抗CIRI神经保护作用，这些有益效应由Nrf2/PINK1/Parkin信号通路激活及后续线粒体自噬增强所介导。